1、 即即核酸核酸DNA分子一級結構的測定，是現代分子生物學一項分子一級結構的測定，是現代分子生物學一項重要的技術重要的技術。 1963年，年，和和等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個個氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。70年年代后期，代后期，和和等人又建立了核酸序列測等人又建立了核酸序列測定的方法，定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法和Maxam-Gilbert化學化學裂解法將核酸序列測定技術推進到裂解法將核酸序列測定技術推進到“直讀直讀”階段，使核酸序列階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質氨基酸序列測

2、定容易，這樣人們可以通過測定變得遠比蛋白質氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質氨基酸的序列。核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質氨基酸的序列。 在四種反應體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位在四種反應體系中，寡聚核苷酸分別終止于不同位置的置的A、T、G或或C堿基，將待測堿基，將待測DNA片段轉變成一系列放片段轉變成一系列放射性核素標記的單鏈射性核素標記的單鏈DNA片斷，并使其一端為一固定的片斷，并使其一端為一固定的末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差末端，而另一端由于長度不同，成為一系列相差1個堿基個堿基的連續末端。經電泳分離，放射自顯影，可直接讀出的連續末端。經電

3、泳分離，放射自顯影，可直接讀出DNA的序列。的序列。 通過測定對突變進行定位和鑒定，應用時測定野通過測定對突變進行定位和鑒定，應用時測定野生型基因上同源區和突變體的相應序列直接在一張膠片上比較二者序生型基因上同源區和突變體的相應序列直接在一張膠片上比較二者序列差異。（已知基因序列）列差異。（已知基因序列） 目的是提供一段目的是提供一段DNA準確的核苷酸序列。（未知基準確的核苷酸序列。（未知基因序列）因序列）對已知基因序列檢查，特別是有遺傳傾向的病例檢測相關基因對已知基因序列檢查，特別是有遺傳傾向的病例檢測相關基因有無突變，有助于闡明疾病發病機理及建立相應診療方案。有無突變，有助于闡明疾病發病機

4、理及建立相應診療方案。對已經克隆的未知序列進行測定，從而闡明該基因的一級結構，對已經克隆的未知序列進行測定，從而闡明該基因的一級結構，如人類基因組計劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順如人類基因組計劃中大量的工作是要闡明克隆片段的核苷酸的排列順序。序。 測序目的不同或靶測序目的不同或靶DNA片段大小有區別，則序列分析的具體方案片段大小有區別，則序列分析的具體方案有所不同，所以測序之前應根據相應情況制訂序列測定的策略，這個有所不同，所以測序之前應根據相應情況制訂序列測定的策略，這個問題在后面將涉及到，但由于學時限制，不可能完全展開來講，請同問題在后面將涉及到，但由于學時限制，不可能完全

5、展開來講，請同學參看相關書籍。學參看相關書籍。 不管是上述哪一種方法，測序基本過程如下：不管是上述哪一種方法，測序基本過程如下：（P255,圖圖10-2） 解決了質粒問題，節省了時間，解決了質粒問題，節省了時間，但缺乏靈活性。但缺乏靈活性。 以酶學測序反應或（和）放標測序以酶學測序反應或（和）放標測序產物為基礎，微機處理。產物為基礎，微機處理。 使極少數測序產物線性放大。使極少數測序產物線性放大。 60.-180.￥，搞定。￥，搞定。 當當3-OH由于脫氧或被取代，下一個核苷酸不能通過由于脫氧或被取代，下一個核苷酸不能通過5磷酸形成磷酸形成3，5磷酸二酯鍵，使鏈的延伸反應終止在這個異常的核苷酸

6、處。如果用相磷酸二酯鍵，使鏈的延伸反應終止在這個異常的核苷酸處。如果用相同的同的4組引物組引物-模板混合物，每一組加模板混合物，每一組加4種種dNTP，其中，其中1種用種用32P（或（或35S）標記，加標記，加1種種ddNTP，每組將產生一種特異性的以，每組將產生一種特異性的以ddNTP為末端的不同為末端的不同長度的核苷酸鏈，經長度的核苷酸鏈，經PAGE分離，即可讀出被測定的全部順序（分離，即可讀出被測定的全部順序（dNTP和和ddNTP競爭結合底物）。（競爭結合底物）。（P255，圖，圖10-2） 在在DNA合成時，利用合成時，利用ddNTP與與dNTP競爭摻入到競爭摻入到新生的新生的DNA

7、鏈上使鏈終止的原理。即在鏈上使鏈終止的原理。即在A、C、G、T 4種反應體系中，分別加入不同的種反應體系中，分別加入不同的ddNTP，其他試劑相，其他試劑相同，經酶促合成反應，生成具有相同的同，經酶促合成反應，生成具有相同的5末端，而末端，而3不不同的同的DNA片段的混合物。經電泳分離，放射自顯影，片段的混合物。經電泳分離，放射自顯影，直接讀出直接讀出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。 酶促測序反應中利用一個與模板特定序列互補的合成寡核苷酶促測序反應中利用一個與模板特定序列互補的合成寡核苷酸作為酸作為DNA合成的引物。合成的引物。 在許多情況下可將靶在許多情況下可將靶DNA片段克隆于片段克隆于

8、M13噬菌體或噬菌粒載噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈體，以取得單鏈DNA分子作為模板。也可用分子作為模板。也可用Sanger法測定變性雙法測定變性雙鏈鏈DNA模板序列（如變性質粒模板序列（如變性質粒DNA）。以上兩種情況都可以采用）。以上兩種情況都可以采用能與位于靶能與位于靶DNA側翼的載體序列相退火的通用引物，不必取得與側翼的載體序列相退火的通用引物，不必取得與未知未知DNA序列互補的引物。序列互補的引物。M13噬菌體重組子的通用測序引物一噬菌體重組子的通用測序引物一般長般長15-29bp，與緊靠，與緊靠M13mp18多克隆位點區的多克隆位點區的HindIII或或M13mp19多克隆位點區多

9、克隆位點區EcoRI位點的序列互補。這些引物同樣也位點的序列互補。這些引物同樣也可用于可用于PUC質粒的質粒的DNA進行進行“雙鏈雙鏈”測序，并且已經商品化。測序，并且已經商品化。 純單鏈純單鏈DNA和經過熱變性或堿變性的雙鏈和經過熱變性或堿變性的雙鏈DNA都可以都可以用作用作Sanger法測定的模板。模板的質量和所用的法測定的模板。模板的質量和所用的DNA聚合聚合酶的種類是至關重要的。酶的種類是至關重要的。 通常采用通常采用M13噬菌體顆粒分離到的單鏈噬菌體顆粒分離到的單鏈DNA模板效果模板效果最佳，用變性雙鏈最佳，用變性雙鏈DNA作模板則難獲此效果。小量制備質作模板則難獲此效果。小量制備質

10、粒粒DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑聚合酶抑制劑所污染，前兩者可被用作隨機引物，造成假象和強終制劑所污染，前兩者可被用作隨機引物，造成假象和強終止現象，使測序膠含糊不清。采用小量制備質粒止現象，使測序膠含糊不清。采用小量制備質粒DNA測定測定未知未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙溴化乙錠梯度離心結果純化質粒錠梯度離心結果純化質粒DNA，測序結果會好得多，但又，測序結果會好得多，但又耗費大量的人力和物力。耗費大量的人力和物力。 因為因為DNA是相當大的分子，一般由幾是相當大的分子，一般由幾

11、kb組成，最小的質粒和病毒組成，最小的質粒和病毒也在也在1kb以上，而測序的最好方法，一次也只能測幾百個以上，而測序的最好方法，一次也只能測幾百個bp（以（以300-500bp為好，為好，300bp最佳），所以測序前，可以用最佳），所以測序前，可以用2種限制酶消化待測種限制酶消化待測DNA，使其降解成小片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收。回收片段，使其降解成小片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收。回收片段，如果超過如果超過700-800bp，則進行第二次限制酶消化，再次分離回收。然，則進行第二次限制酶消化，再次分離回收。然后分別測定每個片段的順序。由于兩種限制酶在后分別測定每個片段的順序。由于兩種限制酶

12、在DNA鏈上的切點位置鏈上的切點位置不同，產生的片段之間有交錯重疊順序，據不同，產生的片段之間有交錯重疊順序，據2片段的這種末端重疊現片段的這種末端重疊現象，用計算機定出各片段的位置，而排出象，用計算機定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。的全部序列。 在測序中，小片段在測序中，小片段DNA只需直接克隆到只需直接克隆到M13mp或者質粒載體中，或者質粒載體中，進行雙鏈或單鏈模板測序。現在常用的進行雙鏈或單鏈模板測序。現在常用的M13mp載體一般是成對設計，載體一般是成對設計，如如M13mp18與與M13mp19都有相同的多克隆位點，但方向相反。同一都有相同的多克隆位點，但方向相反。同一待測

13、的待測的DNA片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進行測序。片段分別克隆到這兩個載體中，用一通用引物進行測序。對于數對于數kb大片段大片段DNA分子，則有幾種策略，如定向克隆，內部片段克分子，則有幾種策略，如定向克隆，內部片段克隆，原位亞克隆，包含上述用隆，原位亞克隆，包含上述用2種限制酶消化種限制酶消化DNA等。等。-是寄生在細菌的病毒。存在是寄生在細菌的病毒。存在3種狀態，有尾種狀態，有尾20面體，無尾面體，無尾20面體和絲狀單鏈噬菌體（面體和絲狀單鏈噬菌體（filamentous），），M13是一類雄性特異的大腸桿是一類雄性特異的大腸桿菌噬菌體，含單鏈環狀的菌噬菌體，含單鏈環狀的DN

14、A。它感染細菌（宿主菌）呈溶原狀態生長，在。它感染細菌（宿主菌）呈溶原狀態生長，在菌體內形成過渡階段雙鏈環狀復制型菌體內形成過渡階段雙鏈環狀復制型DNA（Replicative form DNA，RF DNA），在適當的條件下，可以擴增至數百個拷貝。成熟的噬菌體成為單鏈），在適當的條件下，可以擴增至數百個拷貝。成熟的噬菌體成為單鏈（正鏈、（正鏈、RF則以正鏈為模板復制則以正鏈為模板復制1條鏈，再以此鏈復制正鏈）分泌到培養液條鏈，再以此鏈復制正鏈）分泌到培養液中。因此雙鏈中。因此雙鏈DNA（RF）可以按質粒提取方法從細菌細胞中制備，做為克隆）可以按質粒提取方法從細菌細胞中制備，做為克隆所用的載體

15、。從培養上清液提取成熟的單鏈所用的載體。從培養上清液提取成熟的單鏈DNA做為測序模板。做為測序模板。 在感染過程中，在感染過程中，M13并不殺死細胞，但細胞的生長受到某種程度抑制。并不殺死細胞，但細胞的生長受到某種程度抑制。dsDNA復制又產生大量的復制又產生大量的ssDNA，它被，它被1個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，個外殼蛋白包裝成成熟的噬菌體，在細胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是在細胞生長的過程中，子代噬菌體顆粒釋放出來，這是M13不同于其他噬菌不同于其他噬菌體的特點。每體的特點。每ml培養液沉淀的噬菌體可提取培養液沉淀的噬菌體可提取5-10mgssDNA，產量是很高的。，產量

16、是很高的。用作克隆載體，用作克隆載體，M13有有1個得天獨厚的優點，即可產生大量含有外源個得天獨厚的優點，即可產生大量含有外源DNA其其中中1條鏈的條鏈的DNA分子，后者可在下列工作中充作模板：分子，后者可在下列工作中充作模板： 都是從同一重組都是從同一重組M13mp1改造而來。改造而來。在基因在基因II-IV（500bp，570bp左右）之間有左右）之間有1個多克隆位點個多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）可供外源基因插入。）可供外源基因插入。該區域（該區域（MCS）插入了）插入了1小段小段Ecoli.DNA，有，有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（LacZ）的調

17、控序列及其）的調控序列及其N端端146個個aa編碼信息，它與宿主菌（含編碼信息，它與宿主菌（含LacZ）-互補，形成有活性的互補，形成有活性的-半乳糖苷酶，使平板上底半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成藍噬菌斑，生色成藍噬菌斑，當外源基因插入當外源基因插入MCS，破壞了，破壞了-互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。互補，幾乎無一例外生成無色（白）噬斑。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標志。這是一種非常有效的克隆篩選選擇性標志。是一對載體，它們有相同的是一對載體，它們有相同的13個多克隆個多克隆位點，但方向相反。（當位點，但方向相反。（當RF DNA被兩種限制酶切割后，被兩種限制酶切割后，M

18、13mp18和和M13mp19輕易不能重新環化，當連接混合液中含外源匹配末端輕易不能重新環化，當連接混合液中含外源匹配末端dsDNA片片段時方閉合成環，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣段時方閉合成環，這一片段在二者中將以互為相反的兩個方向插入。這樣M13mp18正鏈中含有外源正鏈中含有外源DNA的一條鏈，而在的一條鏈，而在M13mp19正鏈中含外源正鏈中含外源DNA的另一條鏈）。所以的另一條鏈）。所以M13mp18和和M13mp19作為一對載體可用同一通作為一對載體可用同一通用引物，（從所插入用引物，（從所插入DNA片段任一端開始），測定互為相反兩條鏈的片段任一端開始），測定互

19、為相反兩條鏈的DNA序列。（并可制備只與外源序列。（并可制備只與外源DNA任意任意1條條DNA鏈互補的探針）。（分子克鏈互補的探針）。（分子克隆隆P202）。）。 測定數測定數kb的的DNA序列時，可以建立一系列一端刪切序列時，可以建立一系列一端刪切200-300bp的的DNA片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續讀出該大片段片段次級克隆。對它們分別測序，就可以連續讀出該大片段DNA的全部序列。核酸酶的全部序列。核酸酶BAL31和核酸外切酶和核酸外切酶III，均可以達到連續刪切的目，均可以達到連續刪切的目的。的。-是從乳白短桿菌（是從乳白短桿菌（Brevibacterium albidum）

20、細）細菌中分離。它能以漸進的方式將線型菌中分離。它能以漸進的方式將線型DNA分子的分子的3，5兩端同時降解，兩端同時降解，形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以形成小的寡核苷酸片段或單核苷酸。底物可以是帶延伸末端的，也可以是平頭末端的是平頭末端的dsDNA，對，對3，5兩端降解有同樣性，此酶要求兩端降解有同樣性，此酶要求Ca2+作輔作輔因子，以因子，以EDTA作螯合劑，可使該酶失活。作螯合劑，可使該酶失活。 BAL31還有較弱的單鏈特異內切酶活性，與核酸酶還有較弱的單鏈特異內切酶活性，與核酸酶S1相似，降解相似，降解ssDNA或或ssRNA形成形成5磷酸末端的單或寡核苷

21、酸酶片段，能從磷酸末端的單或寡核苷酸酶片段，能從DNA片片段中切除單鏈尾巴，產生平頭末端。核酸酶段中切除單鏈尾巴，產生平頭末端。核酸酶S1是從米曲霉是從米曲霉（Aspergillus Oryze）中分離的。）中分離的。-是一種從是一種從E.coli中分離，從中分離，從dsDNA的的3-OH末端降末端降解產生解產生5單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶單核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶III還有內核酸酶，還有內核酸酶，RnaseH和和3-磷酸酶的活性。磷酸酶的活性。 Klenow大片段大片段-DDDPI是由分子量是由分子量109KD一條多肽鏈組成，此酶可被一條多肽鏈組成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解

22、成枯草桿菌蛋白酶分解成2個片段，個片段，1個片段分子量為個片段分子量為76KD，有聚合酶，有聚合酶，35外切酶活力，此片段稱為外切酶活力，此片段稱為Klenow片段，另一片段片段，另一片段34KD，有，有5外切外切酶活力。酶活力。 此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進行測序常常產生較高的本底和此酶是末端終止法最早采用的酶，用它進行測序常常產生較高的本底和假帶，催化鏈延伸反應的能力也較差，通常只能讀出距引物假帶，催化鏈延伸反應的能力也較差，通常只能讀出距引物250個核苷酸以個核苷酸以內的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列內的序列。此酶價格便宜，容易獲得，對于已知序列DNA次級克隆的鑒定次

23、級克隆的鑒定仍有應用價值。仍有應用價值。 測序酶是經過改造的測序酶是經過改造的T7噬菌體噬菌體DNA聚合酶，消除了聚合酶，消除了35外切酶活性。外切酶活性。活性非常穩定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應速度，是測定較長活性非常穩定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應速度，是測定較長DNA序列的首選酶。該酶及名稱是序列的首選酶。該酶及名稱是HSB公司的專利。試劑盒已商品化。公司的專利。試劑盒已商品化。 Taq酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫酶用于序列測定，除具有很好的鏈延伸性能外，還可以在高溫（70-80）進行反應的優點，因而能克服富含）進行反應的優點，因而能克服富含

24、GC序列的模板形成自身二序列的模板形成自身二級結構對測定的影響，將級結構對測定的影響，將PCR與末端終止法測序結合進行，只需少量模板。與末端終止法測序結合進行，只需少量模板。 傳統傳統32P-dNTP，由于，由于32P衰變過程中產生高能的衰變過程中產生高能的射線，導致射線，導致放射自顯影圖譜條帶擴散，分辨率低，限制了識讀序列的數量。放射自顯影圖譜條帶擴散，分辨率低，限制了識讀序列的數量。另外，由于另外，由于32P對對DNA樣品輻射分解作用很強，通常都在測序反應樣品輻射分解作用很強，通常都在測序反應后后24小時內上樣電泳，否則無法得到滿意的結果。小時內上樣電泳，否則無法得到滿意的結果。 -32S

25、-dNTP近年來得到廣泛使用，它解決了近年來得到廣泛使用，它解決了32P的兩大缺點，的兩大缺點，具有很高的分辨率，較低的本底。測序反應產物具有很高的分辨率，較低的本底。測序反應產物-20保存一周并保存一周并不明顯影響反應結果。不明顯影響反應結果。（一）制膠（一）制膠（二）模板變性（雙鏈）（二）模板變性（雙鏈）（三）測序反應（三）測序反應 1、模板引物退火、模板引物退火 2、鏈延伸、鏈標記、鏈終止反應、鏈延伸、鏈標記、鏈終止反應 3、上樣電泳、上樣電泳 4、讀片（序）、讀片（序） （分子克隆（分子克隆P640） （必須經過實踐才能獲得技巧）（必須經過實踐才能獲得技巧） 1、將待測、將待測DNA與

26、與M13mp載體相連，構成重組體。載體相連，構成重組體。 2、用兩種限制酶從待測、用兩種限制酶從待測DNA片段的一端與載體序列之片段的一端與載體序列之間將間將DNA切斷，產生線性切斷，產生線性DNA，使近待測，使近待測DNA片段的一端片段的一端為為5突出末端，近載體一端為突出末端，近載體一端為3突出末端。突出末端。 3、外切核酸酶、外切核酸酶從從5突出末端消化待測突出末端消化待測DNA，37C時，每分鐘水解時，每分鐘水解250個核苷酸個核苷酸 4、核酸酶、核酸酶SI去除殘余單鏈，自我環化，轉化或轉染宿去除殘余單鏈，自我環化，轉化或轉染宿主菌得到次級克隆。主菌得到次級克隆。 5、將各克隆用于測序

27、。、將各克隆用于測序。（三）引物延伸法（三）引物延伸法 是一種定向測序法，從是一種定向測序法，從DNA的的3依賴特定引依賴特定引物延伸測定一段物延伸測定一段DNA序列，再根據測得序列設計序列，再根據測得序列設計新的引物，作下一延伸反應的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反應的引物，如此向前推進，最終測得進，最終測得DNA的全長序列。的全長序列。 （直讀，（直讀，Sanger雙脫氧末端法也是直讀法）雙脫氧末端法也是直讀法）法是法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年創建的，用來測定年創建的，用來測定DNA序序列。列。化學法是用化學試劑在化學法是用化學試劑在A、G、C、T處特定地裂解處

28、特定地裂解DNA片段，產生一簇各種長度的短鏈（等差數列片段，產生一簇各種長度的短鏈（等差數列 n=1），經過），經過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。的順序。 某些試劑能修飾或破壞某些試劑能修飾或破壞DNA鏈上特定核苷酸的堿基進而鏈上特定核苷酸的堿基進而使使N-糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環以糖苷鍵斷裂，暴露出的糖環以-消除反應，在消除反應，在3和和5位位上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環的試劑是硫酸上斷裂磷酸二酯鍵。使戊糖脫落，用于嘌呤環的試劑是硫酸二甲酯，而聯氨可用于肼解嘧啶環。二甲酯，而聯氨可用于肼解嘧啶環。4種核苷酸的特異裂解種核苷酸的特異裂

29、解和鑒別方法如下：和鑒別方法如下： G反應反應-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開甲基化，其后斷開了了C8-C9間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結合。間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結合。 G+A反應反應-（哌啶）甲酸使嘌呤環上氮原子質子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤環上氮原子質子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應反應-肼斷開了嘧啶環，產生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環，產生堿基片段被哌啶置換。 C反應反應-在在NaCl

30、存在時，只有存在時，只有C才能與肼發生反應，隨后，才能與肼發生反應，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。限制酶消化待測限制酶消化待測DNA，得到長度為，得到長度為100-200bp的一組片段，純化回的一組片段，純化回收每收每1個片段作為測序材料。個片段作為測序材料。堿性磷酸酶處理消除堿性磷酸酶處理消除5磷酸。磷酸。多核苷酸酶催多核苷酸酶催32PdNTP標記（標記（5-OH）末端。）末端。使標記片段變性為單鏈。使標記片段變性為單鏈。分成分成4-5個反應體系，按上述程序（表或個反應體系，按上述程序（表或4個機制）化學處理，嚴格個機制）化學處理，嚴格控制反應條件。（使得平均每控

31、制反應條件。（使得平均每1個個DNA分子只有分子只有1個位置被斷裂，這種斷裂個位置被斷裂，這種斷裂是隨機的，如是隨機的，如G反應，則在反應，則在DNA鏈上任意位置鏈上任意位置G斷裂），斷裂），DNA鏈上每鏈上每50-100堿基只有堿基只有1個被裂解，這樣，每個反應中雖然都在同一核苷酸處斷裂個被裂解，這樣，每個反應中雖然都在同一核苷酸處斷裂DNA鏈，但由于堿基位置不同，產生鏈，但由于堿基位置不同，產生1組不同長度的組不同長度的DNA片段。其長度可片段。其長度可由幾個核苷酸到接近待測由幾個核苷酸到接近待測DNA全長。全長。電泳電泳放射自顯影放射自顯影4個反應管統一閱讀，個反應管統一閱讀，DNA4個堿基每