1、核酸提取及常見問題分析（一）DNA主講人：張蕾主講人：張蕾09年年8月月12日日第二部分：第二部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第三部分：第三部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策內容第一部分：前言第一部分：前言核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作最基本的操作 。第二部分：第二部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介q 基因組基因組DNADNA的提取的提

2、取CTAB法法SDS法法其它其它q 線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取差速離心結合差速離心結合SDS裂解法裂解法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取經典方法）提取經典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。物。該復合物在高鹽溶液中（該復合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使

3、核酸分離抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。出來。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預熱。植物材料之前必須預熱。qCTAB提取緩沖液的經典配方提取緩沖液的經典配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙巰基乙醇醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使）使用前加入用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞；提供一個緩沖環境，防止核酸被破

4、壞；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一個高鹽環境，使提供一個高鹽環境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除qCTAB提取緩沖液的改進配方提取緩沖液的改進配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙巰基乙醇醇 終濃終濃度度 100 mM

5、20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加使用前加入入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。和多糖結合，有效去除多糖。qCTAB法流程圖法流程圖植物材料植物材料裂解液裂解液上層溶液上層溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提細胞裂解細胞裂解干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS法原理法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑

6、，在高溫（5565）條件下能裂解細）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質及多糖濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃終濃度度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取緩沖液提取緩沖液q SDS

7、 SDS法流程圖法流程圖 （以動物組織為例）（以動物組織為例） 動物組織動物組織細胞裂解細胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、超聲波法、研磨法、凍融法凍融法化學方式化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根據細胞裂解方式的不同有：根據細胞裂解方式的不同有：吸附材料結合法：吸附材料結合法：q根據核酸分離純化方式的不同有：根據核酸分離純化方式的不同有：硅質材料硅質材料陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值

8、結合核酸，低鹽高值結合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫?？旖莞咝??？旖莞咝?。低鹽高低鹽高pHpH值結合核酸，高鹽低值結合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實驗。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。物，從而達到分離目的。濃鹽法濃鹽法：有機溶劑抽提法有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內容物密度

9、不同的原理分離各種內容物利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物q差速離心法原理差速離心法原理 是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進行離心，比重大的物質優先沉降，比重小的卻處于上層，行離心，比重大的物質優先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內半自主性細胞器，自身可編碼蛋線粒體和葉綠體是生物體內半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內的沉降速度比重和大小一定，因而

10、在同一離心場內的沉降速度也一定，根據這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內各也一定，根據這一原理，常用不同轉速的離心法，將細胞內各種組分分級分離出來。種組分分級分離出來。第二部分：第二部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策第三部分：第三部分：DNA提取常見問題、提取常見問題、原因分析及其對策原因分析及其對策I.I.材料準備材料準備II.II.破碎細胞或包膜內容物釋放破碎細胞或包膜內容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質沉淀或吸附核酸，并去除雜質 V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中

11、最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）時，要選擇有核細胞（白細胞） 組培細胞培養時間不能過長，否則會造成組培細胞培養時間不能過長，否則會造成DNA降解降解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較少，提取前先富集含量較少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取 材料應適量，過多會影響裂解，導致材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低量少，純度低 針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：植物材料液氮研磨植物

12、材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體時，應提供相應的緩沖體系系 采用有機（酚采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方針對不同材料的特點，在提

13、取過程中輔以相應的去雜質的方法法基因組基因組DNADNA的提取的提取q 蛋白質的去除：蛋白質的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可以

14、與多糖的羥基作用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結合的試劑：如加入易與酚類結合的試劑：如PVPPV

15、P、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNADNA的結合的結合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌 當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分分 沉淀時加入沉淀時加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀），有利于充分沉淀 沉淀后應用沉淀后應用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發（不要過分干燥） 若長期儲存建議

16、使用若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNasepH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發生酸解發生酸解 基因組基因組DNADNA的提取的提取1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚類雜質糖、多酚類雜質2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續酶解反應后續酶解反應3.3.DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子1.1.重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質（具體方法見前）質（具體方法見前）2.2.重新沉淀重新沉

17、淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發充分揮發3.3.增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數（次數（2-32-3次）次）q問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續酶解和樣品不純，抑制后續酶解和PCRPCR反應。反應。 原原因因對對策策1.1.材料不新鮮或反復凍材料不新鮮或反復凍融融2.2.未很好抑制內源核酸未很好抑制內源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復凍融反復凍融1.1.盡量取新鮮材料，低溫保存材盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融料避免反復凍融2.2.液氮研磨或

18、勻漿組織后，應在液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液解凍前加入裂解緩沖液3.3.在提取內源核酸酶含量豐富的在提取內源核酸酶含量豐富的材料的材料的DNADNA時，可增加裂解液時，可增加裂解液中螯合劑的含量中螯合劑的含量4.4.細胞裂解后的后續操作應盡量細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔輕柔5.5.所有試劑用無菌水配制，耗材所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌經高溫滅菌6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融避免反復凍融q問題二：問題二：DNADNA降解。降解。對對策策 原原因因1.1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時洗滌時DNADNA丟失丟失1.1.盡量選用新鮮（