1、蛋白質組學研究概況蛋白質組學研究概況主主 要要 內內 容容v基本概念基本概念v蛋白質組研究的意義和背景蛋白質組研究的意義和背景v國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v蛋白質組研究進展蛋白質組研究進展v蛋白質組研究主要技術蛋白質組研究主要技術v蛋白質組研究現狀與前景蛋白質組研究現狀與前景一、一、基基 本本 概概 念念v蛋白質組蛋白質組：根據：根據 MR Wilkins等的定義，等的定義，“Pro-teome”來源于來源于protein和和genome, 意思是：意思是：pro-teins expressed by a genome，即由一個基因組，即由一個基因組表達的全套蛋白質。表達的全

2、套蛋白質。Swanbanks則指出則指出“pro-teome”代表一完整生物的全套蛋白質。代表一完整生物的全套蛋白質。 Kahn P則認為則認為“proteome”反映不同細胞的不同蛋白質反映不同細胞的不同蛋白質組合。故組合。故“proteome”是指：是指：一個基因組，一種一個基因組，一種生物或一種細胞生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白質組織所表達的全套蛋白質。一、一、基基 本本 概概 念念v蛋白質組學蛋白質組學（Proteomics）：以蛋白質組為研究對）：以蛋白質組為研究對象，研究細胞內所有蛋白質及其動態變化規律的一象，研究細胞內所有蛋白質及其動態變化規律的一門學科領域。門學科領域。v

3、功能蛋白質組功能蛋白質組（Functional Proteome）：指在特定：指在特定時間、特定環境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋時間、特定環境和實驗條件下基因組活躍表達的蛋白質。白質。v功能蛋白質組學功能蛋白質組學(Functional Proteomics)：研究細胞：研究細胞內與某種功能有關或在某種條件下的一群蛋白質內與某種功能有關或在某種條件下的一群蛋白質 。二、二、蛋白質組研究的意義蛋白質組研究的意義v了解生命現象本質了解生命現象本質：基因組僅大概給出人類及其：基因組僅大概給出人類及其他生物基因的數量，但沒有給出基因的功能；他生物基因的數量，但沒有給出基因的功能；v解釋疾病的發生機制

4、解釋疾病的發生機制：正常情況和非正常情況細：正常情況和非正常情況細胞表達蛋白的差異及產生的后果；胞表達蛋白的差異及產生的后果；v診斷疾病診斷疾病：根據蛋白表達的差異及統計學的結果，：根據蛋白表達的差異及統計學的結果，對疾病進行診斷；對疾病進行診斷；v治療疾病治療疾病：對疾病的治療提出方案，發現藥物靶：對疾病的治療提出方案，發現藥物靶點，設計新藥；點，設計新藥；v通過不同生物蛋白質組研究生物進化、利用其他通過不同生物蛋白質組研究生物進化、利用其他生物生物為人類服務為人類服務。二、二、蛋白質組研究的背景蛋白質組研究的背景v人類基因組和其他許多生物基因組測序工作飛人類基因組和其他許多生物基因組測序工

5、作飛速發展；速發展；v已經測序的推測基因有已經測序的推測基因有40-60%都未明編碼蛋白都未明編碼蛋白質功能；質功能；v 1994年年Williams和和Wilkins首先提出蛋白組首先提出蛋白組；v蛋白質的生物合成是多級調控和后修飾的；蛋白質的生物合成是多級調控和后修飾的；v生命現象不是靠單蛋白反映其復雜性和可變性；生命現象不是靠單蛋白反映其復雜性和可變性；v生物技術的發展為蛋白質組研究提供了條件。生物技術的發展為蛋白質組研究提供了條件。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v3.1 蛋白質組研究的開端蛋白質組研究的開端 1994年年Williams和和Wilkins首先提出蛋

6、白質組首先提出蛋白質組概念；概念；1995年由年由Wasinger等首篇關于等首篇關于proteom的研究論文發表于的研究論文發表于Electrophoresis雜志；雜志；1996年澳大利亞建立了第一個蛋白質組研究中心年澳大利亞建立了第一個蛋白質組研究中心; 1997年年Cordwell和和Humphery-Smith提出提出功能功能蛋白質組蛋白質組概念。概念。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v3.1 蛋白質組研究的發展速度與規模蛋白質組研究的發展速度與規模研究論文增長速度研究論文增長速度三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v研究機構研究機構：澳大利亞：澳

7、大利亞：2家；丹麥：家；丹麥：1家；美國：家；美國：2家。家。v參與國家參與國家：1995年年 一家（澳）；一家（澳）；1997年年 美，丹，美，丹，2瑞，英，法，日，意和德等。瑞，英，法，日，意和德等。v國際知名學府國際知名學府：哈佛，斯坦佛，耶魯，密執安，：哈佛，斯坦佛，耶魯，密執安，華盛頓大學，歐洲分子生物學實驗室，巴斯德華盛頓大學，歐洲分子生物學實驗室，巴斯德研究所，瑞士聯邦工業學院。研究所，瑞士聯邦工業學院。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v3.2 研究材料研究材料 原核微生物（支原體）原核微生物（支原體） 單細胞真核生單細胞真核生物物 （酵母）（酵母） 多細胞真

8、核生物（線蟲）多細胞真核生物（線蟲） 人人體正常組織和病理標本。體正常組織和病理標本。v3.3 研究范圍研究范圍 A. 蛋白質；蛋白質；B. 基因；基因； C. 重要生命活動的重要生命活動的分子機制；分子機制； D. 醫藥靶分子尋找與分析。醫藥靶分子尋找與分析。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v 3.4 國外研究現狀國外研究現狀： 根據根據2001年年5月月23日日公布的結果，已有公布的結果，已有67種種生物體的基因組全序列完成，包括生物體的基因組全序列完成，包括11個古細菌，個古細菌，41個細菌和個細菌和15個真核生物。此外，還有個真核生物。此外，還有208個原個原核生物

9、和核生物和152個真核生物基因組正在測序；個真核生物基因組正在測序；2002年年3月月報道已有報道已有600種生物基因組完成測序工作，種生物基因組完成測序工作，其中其中170種為真核生物。種為真核生物。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v國際方面國際方面： A. 1997年構建成第一個完整的蛋白質組數據庫年構建成第一個完整的蛋白質組數據庫酵母酵母蛋白質數據庫（蛋白質數據庫（YPD）；1997年舉行了第一次年舉行了第一次國際國際“蛋白質組學蛋白質組學”會議會議。 B. 各國政府加大資金投入各國政府加大資金投入：美國美國國立研究院在密執安醫學國立研究院在密執安醫學院投入院投入$1

10、000萬建立有關肺、直腸、乳腺和卵巢等腫瘤萬建立有關肺、直腸、乳腺和卵巢等腫瘤蛋白質組數據庫；蛋白質組數據庫；歐共體歐共體資助酵母蛋白質組研究；資助酵母蛋白質組研究；英國英國資助資助3個研究中心對已完成或即將完成的基因組序列進個研究中心對已完成或即將完成的基因組序列進行蛋白質組研究；行蛋白質組研究；法、德、澳、日法、德、澳、日等投入巨資。等投入巨資。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況 C. 各商業公司對蛋白質組研究進行巨額投資各商業公司對蛋白質組研究進行巨額投資： 當今世界上當今世界上 一些一些大制藥集團大制藥集團如如Ciba-Geigy和和Sandoz合合資建立的資建立的N

11、ovartis公司，投資公司，投資$2.5億億建立基因研究所；建立基因研究所；Glaxo-Wellcome在基因組研究領域投入在基因組研究領域投入$ 4700萬，萬，研究人員研究人員增加一倍；增加一倍；Smith Kline公司花公司花$1.25億億擴展人基因組的測序。擴展人基因組的測序。 獨立完成人類基因組測序的獨立完成人類基因組測序的Celera公司公司投資近億美元；投資近億美元；日內瓦日內瓦蛋白質公司與布魯克質譜儀公司聯合成立了國際上蛋白質公司與布魯克質譜儀公司聯合成立了國際上最大的蛋白質組研究中心；最大的蛋白質組研究中心；1998年在舊金山召開的第二屆年在舊金山召開的第二屆蛋白質組會議

12、，參加會議者大部分來自世界級的大公司和蛋白質組會議，參加會議者大部分來自世界級的大公司和藥廠。藥廠。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v蛋白質組學的前沿蛋白質組學的前沿： A. Compositional proteomics: 針對有基因組或轉錄針對有基因組或轉錄組數據庫的生物體或組織組數據庫的生物體或組織/細胞，建立其蛋白質組或細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組（或蛋白質表達譜）及蛋白質組連鎖群。亞蛋白質組（或蛋白質表達譜）及蛋白質組連鎖群。 B. Comparative proteomics: 以重要生命過程或人類以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理和病理體系

13、或過程重大疾病為對象，進行重要生理和病理體系或過程的比較蛋白質組學研究。的比較蛋白質組學研究。 C. 蛋白質組學支撐蛋白質組學支撐技術平臺技術平臺和和生物信息學生物信息學的研究。的研究。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v3.5 國內研究現狀國內研究現狀： 在在1995年年國際上發表第一篇蛋白質組論文后，國際上發表第一篇蛋白質組論文后，國家基金委重視蛋白質組研究，國家基金委重視蛋白質組研究，1997年年設立了重設立了重大項目大項目“蛋白質組學技術體系的建立蛋白質組學技術體系的建立”。同時，。同時，中國科學院生化所、軍事醫科院和湖南師范大學中國科學院生化所、軍事醫科院和湖南師范

14、大學啟動了蛋白質組研究。目前，中科院上海生命科啟動了蛋白質組研究。目前，中科院上海生命科學院、軍事醫科院、復旦大學等單位相繼成立了學院、軍事醫科院、復旦大學等單位相繼成立了專門的蛋白質組研究中心。專門的蛋白質組研究中心。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v蛋白質組研究技術平臺，達到或接近國際先蛋白質組研究技術平臺，達到或接近國際先進水平；進水平；v在一些重大疾病蛋白質組研究方面獲得在一些重大疾病蛋白質組研究方面獲得 了不了不少成就：肝癌、心血管疾病、白血病等疾病少成就：肝癌、心血管疾病、白血病等疾病基因表達譜方面做出了與國際前沿水平相當基因表達譜方面做出了與國際前沿水平相當的

15、工作。的工作。三、三、國內外蛋白質組研究概況國內外蛋白質組研究概況v3.6 蛋白質組研究的發展趨勢及我國的應蛋白質組研究的發展趨勢及我國的應對策略對策略 A.重要生命活動中蛋白質組的比較研究。重要生命活動中蛋白質組的比較研究。 B. 12種組織或細胞蛋白質組的系統研究種組織或細胞蛋白質組的系統研究. C. 蛋白質組的生物信息蛋白質組的生物信息 學研究學研究. D. 蛋白質組分析的支撐技術研究。蛋白質組分析的支撐技術研究。四、四、蛋白質組研究進展蛋白質組研究進展v原核生物及簡單真核生物的蛋白質組原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究；研究；v多細胞真核生物的蛋白質組研究多細胞真核生物的蛋白質組研究

16、v人類蛋白質組研究人類蛋白質組研究4.1 原核生物及簡單真核生物的原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究蛋白質組研究v蛋白質組研究目前還主要集中于原核生蛋白質組研究目前還主要集中于原核生物和一些簡單的真核生物，尤其是一些物和一些簡單的真核生物，尤其是一些基因組序列被完全搞清楚或大部分已知基因組序列被完全搞清楚或大部分已知的生物，如支原體、細菌、酵母等。的生物，如支原體、細菌、酵母等。4.1 原核生物及簡單真核生物的原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究蛋白質組研究4.1.1 流感嗜血桿菌的蛋白質組研究流感嗜血桿菌的蛋白質組研究 第一個獲得基因組全序列的生物。第一個獲得基因組全序列的生物。 瑞士瑞士

17、：2D PAGE pH310，鑒定，鑒定 300個組分；個組分； 麥黃酮膠麥黃酮膠 Mr 520，鑒定，鑒定80個組分；個組分； 肝素親和層析肝素親和層析 pH611，鑒定，鑒定102個組分，許多個組分，許多 為核糖體蛋白。為核糖體蛋白。 美國美國：2D PAGE 分析分析 303個蛋白點，確定個蛋白點，確定263 個蛋白，個蛋白， 大多為外膜蛋白及與能量代謝和大分子合成相關蛋大多為外膜蛋白及與能量代謝和大分子合成相關蛋 白；還發現幾種不能在白；還發現幾種不能在geneome中找到對應序列的中找到對應序列的 蛋白。蛋白。 約約22%被鑒定的蛋白與預計的等電點和被鑒定的蛋白與預計的等電點和Mr不

18、同，表明可能經不同，表明可能經過翻譯后加工過翻譯后加工。 4.1 原核生物及簡單真核生物的原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究蛋白質組研究v4.1.2 大腸桿菌的蛋白質組研究大腸桿菌的蛋白質組研究 目前，目前，E.coli 全部全部4000多個基因的序列已被測定。人們希望多個基因的序列已被測定。人們希望通過建立蛋白質通過建立蛋白質-基因聯合數據庫，以了解：基因聯合數據庫，以了解： A. 所有編碼基因的產物在雙向圖譜上的位置；所有編碼基因的產物在雙向圖譜上的位置； B. 各種蛋白質的豐度；各種蛋白質的豐度； C. 不同條件下各種蛋白質表達水平及合成速率的變化；不同條件下各種蛋白質表達水平及合成速

19、率的變化； D. 各種蛋白質在細胞內的定位；各種蛋白質在細胞內的定位； E. 某些蛋白質翻譯后的修飾方式及水平。某些蛋白質翻譯后的修飾方式及水平。 現更新至第六版，約現更新至第六版，約1600個蛋白點，其中個蛋白點，其中400對應對應350 個基因。個基因。4.1 原核生物及簡單真核生物的原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究蛋白質組研究v4.1.3 致病微生物的蛋白質組研究致病微生物的蛋白質組研究 A. 闡明新抗生素作用機制的研究闡明新抗生素作用機制的研究 尋找作用于細菌內新靶點的性的抗菌化合物，并揭尋找作用于細菌內新靶點的性的抗菌化合物，并揭示其作用靶點和機制。如在研究抑制核糖體類抗生素對示

20、其作用靶點和機制。如在研究抑制核糖體類抗生素對細菌作用機制時發現，大腸桿菌對冷熱的反應發生于核細菌作用機制時發現，大腸桿菌對冷熱的反應發生于核糖體水平上。糖體水平上。 B. 從整體水平上分析不同條件下蛋白質譜的變化從整體水平上分析不同條件下蛋白質譜的變化。 如比較結核分枝桿菌與牛結核桿菌蛋白的差異，部如比較結核分枝桿菌與牛結核桿菌蛋白的差異，部分解釋近年來牛痘作為結核病疫苗出現失敗的現象分解釋近年來牛痘作為結核病疫苗出現失敗的現象 。 4.1 原核生物及簡單真核生物的原核生物及簡單真核生物的蛋白質組研究蛋白質組研究v4.1.3 釀酒酵母的蛋白質組研究釀酒酵母的蛋白質組研究 釀酒酵母基因組已完成

21、，并在互聯網上建立了蛋白質釀酒酵母基因組已完成，并在互聯網上建立了蛋白質數據庫。最新版數據庫包括數據庫。最新版數據庫包括6000多頁，每頁代表一個已多頁，每頁代表一個已知或推測的酵母蛋白，包括以下信知或推測的酵母蛋白，包括以下信A. 以序列為基礎的已知和推測的酵母蛋白特征信息以序列為基礎的已知和推測的酵母蛋白特征信息 如分子質量，等電點，氨基酸組成，多肽片段大小等；如分子質量，等電點，氨基酸組成，多肽片段大小等；B. 蛋白質在翻譯后加工、亞細胞定位、功能分類信息蛋白質在翻譯后加工、亞細胞定位、功能分類信息C. 蛋白質功能、相互作用、突變表型的有關信息蛋白質功能、相互作用、突變表型的有關信息 4

22、.2 多細胞真核生物的蛋白質組研究多細胞真核生物的蛋白質組研究v4.2.1 線蟲的蛋白質組研究線蟲的蛋白質組研究 Bini 等利用等利用 2-DE 在在 pH 3.59和和Mr10200范圍可范圍可分辨分辨2000個以上蛋白點，用個以上蛋白點，用Edman微量測序技術對其微量測序技術對其中中24個點進行分析，得到個點進行分析，得到12個蛋白個蛋白N端序，其余因端序，其余因N端端封閉而未能測出。封閉而未能測出。 已測已測12個中有一個未能找到與其匹配的基因，另個中有一個未能找到與其匹配的基因，另11個與能量個與能量 代謝、酸性核蛋白、代謝、酸性核蛋白、G蛋白等對應。蛋白等對應。 線蟲的線蟲的19

23、000個基因已于個基因已于1998年年12月全部測出。月全部測出。4.2 多細胞真核生物的蛋白質組研究多細胞真核生物的蛋白質組研究v4.2.2 果蠅的蛋白質組研究果蠅的蛋白質組研究 不同性別果蠅成蟲的頭、胸、腹部的蛋白不同性別果蠅成蟲的頭、胸、腹部的蛋白質組圖譜已被分別作出，總共約有質組圖譜已被分別作出，總共約有1200個蛋白個蛋白質被檢出。其中的大多數在頭、胸、腹部中是質被檢出。其中的大多數在頭、胸、腹部中是相同的，但也發現一部分其部位、性別特異的相同的，但也發現一部分其部位、性別特異的蛋白質。蛋白質。4.3 人類蛋白質組研究人類蛋白質組研究 v人類的蛋白質組研究吸引了最多的注意力。人類的蛋

24、白質組研究吸引了最多的注意力。由于人有著大量的組織、細胞類型和發育階段，由于人有著大量的組織、細胞類型和發育階段，對人蛋白質組的研究主要集中在對人蛋白質組的研究主要集中在特異的組織、特異的組織、細胞和疾病細胞和疾病上。上。v已有證據表明，盡管人的不同組織功能差異，已有證據表明，盡管人的不同組織功能差異，但其許多為但其許多為看家蛋白看家蛋白，故其故其2-DE圖譜是相似圖譜是相似的。而簡單生物在的。而簡單生物在 不同的發育階段有著極不不同的發育階段有著極不同的蛋白質組。同的蛋白質組。4.3 人類蛋白質組研究人類蛋白質組研究v人的各種體液被用于研究與某些疾病的關系：人的各種體液被用于研究與某些疾病的

25、關系：A . 提供疾病診治的新手段提供疾病診治的新手段 如有學者發現眼淚中的一新蛋白極類似于乳腺癌細如有學者發現眼淚中的一新蛋白極類似于乳腺癌細胞里高表達的另一蛋白質。胞里高表達的另一蛋白質。 利用蛋白質組研究發現，乙醇會改變血清蛋白糖利用蛋白質組研究發現，乙醇會改變血清蛋白糖基化作用，導致多糖蛋白的糖基缺乏，如轉鐵蛋白。基化作用，導致多糖蛋白的糖基缺乏，如轉鐵蛋白。B. 提供疾病的早期診斷依據提供疾病的早期診斷依據 如利用不同細胞組織的特征蛋白質譜，可判別一如利用不同細胞組織的特征蛋白質譜，可判別一些難以判定來源的腫瘤細胞的來源。些難以判定來源的腫瘤細胞的來源。五、五、蛋白質組研究主要技術蛋

26、白質組研究主要技術v蛋白質組分離技術蛋白質組分離技術v蛋白質組分析技術蛋白質組分析技術v其它蛋白質組研究方法其它蛋白質組研究方法v蛋白質組數據庫的建立蛋白質組數據庫的建立v生物信息學生物信息學蛋白質組研究技術路線蛋白質組研究技術路線5.1 蛋白質組分離技術蛋白質組分離技術蛋白質分離技術種類蛋白質分離技術種類：v根據分子的大小：分子篩層析、凝膠電根據分子的大小：分子篩層析、凝膠電泳、透析等；泳、透析等；v根據電荷：電泳、離子交換層析等；根據電荷：電泳、離子交換層析等；v根據疏水性：吸附層析、反向層析等；根據疏水性：吸附層析、反向層析等；v根據親和性：親和層析等根據親和性：親和層析等5.1 蛋白質

27、組分離技術蛋白質組分離技術用于蛋白質組研究的分離技術用于蛋白質組研究的分離技術：v 雙向電泳技術（雙向電泳技術（2D電泳或二維電泳）電泳或二維電泳）v高效液相色譜層析高效液相色譜層析5.1.1 雙向電泳技術雙向電泳技術v雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳又稱又稱“二維聚丙烯酰胺凝膠電二維聚丙烯酰胺凝膠電泳泳”（2-DE），由），由OFarrel 以及以及Klose 和和Scheele于于1975年發明的，其年發明的，其原理原理是：是： v第一向第一向根據蛋白質的根據蛋白質的等電點等電點不同即所帶電荷不同即所帶電荷的量不同進行等電聚焦的量不同進行等電聚焦 (IEF)分離分離 ；v第二向第二向根據根據相對分

28、子質量相對分子質量的大小進行分離。的大小進行分離。（SDS-PAGE）5.1.1 雙向電泳技術雙向電泳技術雙向電泳的特點雙向電泳的特點v一次性分離一次性分離: 對樣品的影響最小對樣品的影響最小; 減少樣品的損失。減少樣品的損失。v高靈敏度高靈敏度：10-15-10-18mol水平。水平。v高分辨率高分辨率：經過電荷和分子量的雙重分離，甚至可：經過電荷和分子量的雙重分離，甚至可以分離糖型不同的蛋白成分。以分離糖型不同的蛋白成分。v便于計算機分析處理便于計算機分析處理：對雙向電泳圖譜進行掃描，：對雙向電泳圖譜進行掃描，將蛋白質進行定位，可以建立蛋白質數據庫。將蛋白質進行定位，可以建立蛋白質數據庫。

29、5.1.1 雙向電泳技術雙向電泳技術雙向電泳的特點雙向電泳的特點v與分析鑒定方法相匹配與分析鑒定方法相匹配：雙向電泳的樣品可以：雙向電泳的樣品可以方便轉移到方便轉移到PVDF（polyvinylidene difluoride，聚偏二氟乙烯）膜上，進行聚偏二氟乙烯）膜上，進行N端或端或C端序列分析；端序列分析；更為重要的是可直接對膠上斑點或轉移到膜上更為重要的是可直接對膠上斑點或轉移到膜上的斑點進行酶解，進一步進行質譜分析。的斑點進行酶解，進一步進行質譜分析。5.1.1 雙向電泳技術雙向電泳技術v關鍵參數關鍵參數：v高分辨率高分辨率：使更多使更多 不同種類的蛋白質得以分開；不同種類的蛋白質得以

30、分開； 目前一塊膠（目前一塊膠（16 x 20 cm）可分辨）可分辨3000-4000，甚至，甚至10000個可檢測蛋白點。個可檢測蛋白點。B. 可重復性可重復性：使不同批次不同實驗室在相同的條使不同批次不同實驗室在相同的條件下得到的數據可以相互比較。件下得到的數據可以相互比較。 雙向電泳的基本步驟雙向電泳的基本步驟樣品制備樣品制備v樣品的溶解性樣品的溶解性：可加：可加2mol/L硫脲作助溶劑；硫脲作助溶劑；v樣品的變性樣品的變性：一般用：一般用8mol/L尿素（尿素（勿加熱！勿加熱！）v樣品的還原性樣品的還原性：一般加：一般加DTT（dithiothreitol，二，二硫蘇糖醇硫蘇糖醇) 或

31、或 -巰基乙醇還原二硫鍵巰基乙醇還原二硫鍵.(三正丁基三正丁基膦取代膦取代)v溶液的酸堿性溶液的酸堿性：一般用：一般用40mol/L Tris緩沖溶液。緩沖溶液。雙向電泳的基本步驟雙向電泳的基本步驟第一相等點聚焦第一相等點聚焦：v儀器的選擇儀器的選擇：目前多使用：目前多使用Pharmacia公司或公司或Bio-rad公公司司IPGphor（固相（固相pH梯度電泳儀）類似儀器；梯度電泳儀）類似儀器；v等點聚焦條等點聚焦條：已有商品，：已有商品，pH梯度一般為梯度一般為3-10，還有，還有4-7、6-10、10-12等，根據蛋白成分選擇；等，根據蛋白成分選擇；v上樣量上樣量：一般為：一般為mg計，

32、加大電泳條寬度和長度，可使計，加大電泳條寬度和長度，可使上樣量提高到上樣量提高到100mg；v電泳支撐介質電泳支撐介質：一般使用聚丙烯酰胺，現已有用二甲：一般使用聚丙烯酰胺，現已有用二甲基丙烯酰胺代替丙烯酰胺，進行聚合，可以提高蛋白基丙烯酰胺代替丙烯酰胺，進行聚合，可以提高蛋白質的穩定性。質的穩定性。雙向電泳的基本步驟雙向電泳的基本步驟第二相第二相SDS-PAGE 目前這一部分工作，自動化程度還不高，目前這一部分工作，自動化程度還不高，還靠手工操作，可能在不久的將來會有好還靠手工操作，可能在不久的將來會有好的產品問世。的產品問世。5.1.1 雙向電泳技術雙向電泳技術v面臨的挑戰面臨的挑戰:v低

33、拷貝蛋白的鑒定低拷貝蛋白的鑒定:人體的微量蛋白往往是重要的人體的微量蛋白往往是重要的調節蛋白調節蛋白. 除增加除增加2-DE的靈敏度外的靈敏度外, 將將MALDI質譜質譜用于用于PVDF膜上膜上,可檢出拷貝數低于可檢出拷貝數低于1000的蛋白質的蛋白質.v極酸或極堿蛋白的分離極酸或極堿蛋白的分離;v極大極大(Mr 200) 或極小或極小(Mr 10)蛋白質的分離蛋白質的分離;v難溶蛋白質的分離難溶蛋白質的分離: 包括一些重要的膜蛋白包括一些重要的膜蛋白;v儀器的自動化儀器的自動化.5.1.2 高效液相色譜層析高效液相色譜層析高效液相色譜類型高效液相色譜類型v反向層析、分子篩效應、親和層析、離子

34、交換、吸附層析等反向層析、分子篩效應、親和層析、離子交換、吸附層析等v高效液相色譜的特點高效液相色譜的特點：可以適當放大，分離得到較多的蛋白：可以適當放大，分離得到較多的蛋白量以供鑒定；流出的蛋白峰可直接連通進入質譜進行分析，量以供鑒定；流出的蛋白峰可直接連通進入質譜進行分析，避免了避免了“印跡印跡”的步驟和因此引起的缺點。的步驟和因此引起的缺點。v高效液相色譜的發展高效液相色譜的發展：二相二維柱（又：二相二維柱（又“雙向雙向”高效柱層高效柱層析），即先進行一次分子篩柱層析，從柱上流出的蛋白峰自析），即先進行一次分子篩柱層析，從柱上流出的蛋白峰自動進入第二向層析，通常利用蛋白質表面的親水性質進

35、行分動進入第二向層析，通常利用蛋白質表面的親水性質進行分離的反相柱層析。離的反相柱層析。5.2 蛋白質組分析技術蛋白質組分析技術蛋白質組分析蛋白質組分析v2-DE/PVDF蛋白質斑點的檢測：蛋白質斑點的檢測：v蛋白質的鑒定技術：質譜技術蛋白質的鑒定技術：質譜技術5.2.1 2-DE/PVDF蛋白質的檢測蛋白質的檢測v經典方法有考馬斯亮藍、銀染經典方法有考馬斯亮藍、銀染、銅染等；銅染等；v考馬斯亮藍染色考馬斯亮藍染色：產生低背景，檢測范圍為：產生低背景，檢測范圍為30-100ng，檢測限，檢測限8-10ng。其染色過程是在。其染色過程是在高濃度的三氯乙酸、高氯酸或磷酸中進行，高濃度的三氯乙酸、高

36、氯酸或磷酸中進行，并輔以甲醇或乙醇。但三氯乙酸和乙醇易導并輔以甲醇或乙醇。但三氯乙酸和乙醇易導致谷氨酸羧基側鏈的不可逆酸催化酯基化，致谷氨酸羧基側鏈的不可逆酸催化酯基化，這就使得肽譜數據復雜化。這就使得肽譜數據復雜化。5.2.1 2-DE/PVDF蛋白質的檢測蛋白質的檢測v銀染銀染：靈敏度高（可檢測：靈敏度高（可檢測4ng蛋白蛋白), 但對某些蛋但對某些蛋白質如鈣結合蛋白和糖蛋白染色效果相當差；白質如鈣結合蛋白和糖蛋白染色效果相當差；且且Ag+可與可與Cys殘基相互作用；銀染中的殘基相互作用；銀染中的 戊二醛戊二醛和甲醛會對蛋白質的和甲醛會對蛋白質的 -NH2和和 -NH2 進行烷基化，進行烷

37、基化，即即造成末端封閉，不利于序列分析。造成末端封閉，不利于序列分析。 目前同位素標記、熒光標記、抗體標記已用目前同位素標記、熒光標記、抗體標記已用于蛋白質的檢測。于蛋白質的檢測。(20 x 10-6)5.2.1 2-DE/PVDF蛋白質的檢測蛋白質的檢測v圖譜數字化分析圖譜數字化分析： 將蛋白質電泳后，對電泳圖譜進行掃描將蛋白質電泳后，對電泳圖譜進行掃描和數字化分析，去除縱向和橫向的曳尾以及和數字化分析，去除縱向和橫向的曳尾以及背景底色，給出所有蛋白質斑點的準確位置背景底色，給出所有蛋白質斑點的準確位置和強度，得到布滿蛋白斑點的圖象，即和強度，得到布滿蛋白斑點的圖象，即“參參考膠圖譜考膠圖譜

38、”，建立蛋白質數據庫。，建立蛋白質數據庫。5.2.2 蛋白質的鑒定技術蛋白質的鑒定技術v氨基酸組成分析氨基酸組成分析：適用于含量豐富的蛋白質，一般在蛋白質適用于含量豐富的蛋白質，一般在蛋白質組中很少應用。組中很少應用。v蛋白質氨基酸序列分析法蛋白質氨基酸序列分析法：難以分析末端封閉蛋白質，難以難以分析末端封閉蛋白質，難以分析分析氨基酸氨基酸修飾的蛋白質，作為質譜分析的補充和前提。修飾的蛋白質，作為質譜分析的補充和前提。 蛋白質的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進行蛋白質的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進行的化學反應，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵的形成，以的化學反應，如磷酸化、

39、羥基化、糖基化、二硫鍵的形成，以及蛋白質的自我剪接等等。這對于蛋白質的正常生理功能是必及蛋白質的自我剪接等等。這對于蛋白質的正常生理功能是必需的，其變化往往與疾病的發生有關。如需的，其變化往往與疾病的發生有關。如2-DE中常發現的蛋中常發現的蛋白質拖曳現象，很可能是蛋白的不同翻譯后修飾產物造成的。白質拖曳現象，很可能是蛋白的不同翻譯后修飾產物造成的。拖曳圖象變化在疾病的診斷上可能提供重要信息。拖曳圖象變化在疾病的診斷上可能提供重要信息。5.2.2 蛋白質的鑒定技術蛋白質的鑒定技術v質譜法質譜法：通過質譜數據與序列數據庫相關分析的：通過質譜數據與序列數據庫相關分析的方法，鑒定蛋白質的基礎在于能夠

40、得到一些限制方法，鑒定蛋白質的基礎在于能夠得到一些限制參數，包括蛋白質的氨基酸組成、氨基酸序列、參數，包括蛋白質的氨基酸組成、氨基酸序列、蛋白質和肽段的質量以及肽碎片的質量，利用這蛋白質和肽段的質量以及肽碎片的質量，利用這些參數可以從數據庫中的所有的序列中特異地識些參數可以從數據庫中的所有的序列中特異地識別與這些參數相關的序列。別與這些參數相關的序列。v該法靈敏度較高，是當前蛋白質組分析的主要方該法靈敏度較高，是當前蛋白質組分析的主要方法，但對未知序列難以確定。法，但對未知序列難以確定。 質譜技術質譜技術v質譜分析的原理質譜分析的原理：樣品經離子化后，產生不樣品經離子化后，產生不

41、同的質荷比，經過檢測后確定其分子量，與數同的質荷比，經過檢測后確定其分子量，與數據庫比較，進一步確定其結構。據庫比較，進一步確定其結構。v質譜儀的基本組成質譜儀的基本組成：進樣裝置、離子化源、進樣裝置、離子化源、質量分析器、離子檢測器和數據分析系統。其質量分析器、離子檢測器和數據分析系統。其中離子化源和質量分析器是兩個中心部件中離子化源和質量分析器是兩個中心部件。 質譜技術質譜技術當前與蛋白質組研究相關的質譜技術當前與蛋白質組研究相關的質譜技術v離子源離子源：ESI和和MALDI，其他質譜易于將蛋白質，其他質譜易于將蛋白質打成碎片，難以進行分析。打成碎片，難以進行分析。vESI（

42、electrospray ionization）：電噴霧離子化；）：電噴霧離子化；vMALDI（matrix-assisted laser desorption-ioni-zation）：基質輔助激光）：基質輔助激光解析解析/離子化。離子化。v 這些技術能快而極為準確地測定生物大分子的相這些技術能快而極為準確地測定生物大分子的相對分子質量。對分子質量。 ESIMALDI分析器分析器四級桿、離子四級桿、離子阱分析器阱分析器飛行時間分析器飛行時間分析器（TOF）電離方法電離方法軟電離軟電離軟電離軟電離靈敏度靈敏度pmol-fmolpmol-fmol質量范圍質量范圍100000Da300000Da樣

43、品純度樣品純度要求高要求高要求低要求低肽序列分析肽序列分析功能強功能強功能弱功能弱進樣方式進樣方式液體液體固體固體對修飾蛋白對修飾蛋白功能強功能強功能弱功能弱規模速度規模速度能力弱能力弱能力強能力強ESI與與MALDI的比較的比較在離子化的過程中不會或最多在離子化的過程中不會或最多只部分破壞分子結構只部分破壞分子結構 質譜技術在蛋白質組質譜技術在蛋白質組研究中的應用研究中的應用A. 肽質譜和肽序列分析肽質譜和肽序列分析 將蛋白質組進行雙向電泳，蛋白斑點在將蛋白質組進行雙向電泳，蛋白斑點在膠上或轉移到膠上或轉移到PVDF（polyvinylidene difluoride）膜上進行

44、酶解，再用）膜上進行酶解，再用LC-MS或或MS/MS進行分析，與數據庫比較后得出肽鏈進行分析，與數據庫比較后得出肽鏈結構。結構。實驗方法實驗方法完整蛋白質（如凝膠分離完整蛋白質（如凝膠分離或色譜純化蛋白質）或色譜純化蛋白質） 酶切酶切肽混合物肽混合物質譜測定肽質量質譜測定肽質量（MALDI-MS，ESI-MS）選擇肽段裂解選擇肽段裂解（PSD-MALDI-MS，ESI-MS/MS）計算方法計算方法蛋白質序列數據庫蛋白質序列數據庫(+核酸序列翻譯數據庫核酸序列翻譯數據庫)n肽質量檢索肽質量檢索:(a)計算數據庫中每個序列在給定酶切條計算數據庫中每個序列在給定酶切條件下產生的肽段質量數件下產生的

45、肽段質量數; ;(b)(b)實測肽質量數與計算值相關性比較實測肽質量數與計算值相關性比較; ;(c)(c)將相關性最好的結果排序將相關性最好的結果排序, ,或僅列出有或僅列出有顯著相關的結果顯著相關的結果( (匹配的肽段數目匹配的肽段數目););n未解析碎片離子檢索未解析碎片離子檢索: :(a)(a)計算數據庫中每個序列在給定酶切條計算數據庫中每個序列在給定酶切條件下產生的肽段質量數件下產生的肽段質量數; ;(b)(b)找出與實測質量數一致的肽段找出與實測質量數一致的肽段, ,產生其產生其理論碎片離子列表理論碎片離子列表; ;(c)(c)實測碎片離子質量數與理論碎片離子實測碎片離子質量數與理論

46、碎片離子質量數計算值相關性比較質量數計算值相關性比較; ;(d)(d)將匹配最好的結果排序將匹配最好的結果排序, ,或僅列出有顯或僅列出有顯著相關的結果著相關的結果( (匹配的離子數目匹配的離子數目););質譜鑒定蛋白質資資 源源 網網 址址 特特 點點 CBRG，Eth-Zurich,Switzerland Cbrg.inf.ethz.ch/MassSearch.html 肽質量檢索軟件肽質量檢索軟件 EMBL,Heidelberg,Germany www.mann.embl-heidelberg.de/Ser- vices/PeptideSearch/Pep- tideSearchintr

47、o.html 肽肽質量和碎片離質量和碎片離子檢索軟件子檢索軟件 ExPasy www.expasy.ch/tools/#proteome 肽質量和碎片離肽質量和碎片離子檢索軟件子檢索軟件 Mascot www.matrix- page=/home.html 肽質量和碎片離肽質量和碎片離子檢索軟件子檢索軟件 Rockefeller University New York, USA Prowl.R/ 肽質量和碎片離肽質量和碎片離子檢索軟件子檢索軟件 SEQNET,Daresbury, UK www.seqnet.dl.ac.uk/Bioinformatics/ wela

48、pp/mowse 肽質量和碎片離肽質量和碎片離子檢索軟件子檢索軟件 University of Califonia, San Francisco,USA P 肽質量檢索軟件肽質量檢索軟件(MS-Fit)和碎片離和碎片離子 檢 索 軟 件子 檢 索 軟 件(MS-Tag) University of Washington Thompson.mbt.W/sequest/ 碎片離子檢索軟碎片離子檢索軟件件 SEQUEST 應應用軟件用軟件 用質譜數據鑒定蛋白質的檢索工具網址用質譜數據鑒定蛋白質的檢索工具網址肽質量數鑒定蛋白質肽質量數鑒定蛋

49、白質v由上述檢索途徑鑒定的蛋白質必須是已在序列由上述檢索途徑鑒定的蛋白質必須是已在序列數據庫（翻譯的核酸序列或蛋白序列數據庫）數據庫（翻譯的核酸序列或蛋白序列數據庫）中存在。故極適用于那些基因特性非常清楚的中存在。故極適用于那些基因特性非常清楚的物種，特別是已經建立詳盡的蛋白質或物種，特別是已經建立詳盡的蛋白質或cDNA序列數據庫的物種。序列數據庫的物種。v肽質量檢索蛋白質方法的肽質量檢索蛋白質方法的依據依據是實驗中所獲得是實驗中所獲得蛋白質的多個肽段的質量數據與蛋白質的多個肽段的質量數據與 同一蛋白質肽同一蛋白質肽段質量計算值之間的相關性。段質量計算值之間的相關性。肽質量數鑒定蛋白質肽質量數

50、鑒定蛋白質決定性參數決定性參數：v1. 肽質量測量的精確度肽質量測量的精確度：質量精確度越高，結果：質量精確度越高，結果判斷越可信。這依賴于所使用的儀器及其操作。判斷越可信。這依賴于所使用的儀器及其操作。v“正交法正交法”：為進一步增加肽質量的可信度，對：為進一步增加肽質量的可信度，對單個肽段氨基酸序列或組成提供額外或限制性信單個肽段氨基酸序列或組成提供額外或限制性信息，限制用肽質量在數據庫中檢索鑒定蛋白質產息，限制用肽質量在數據庫中檢索鑒定蛋白質產生的多個肽段與同一質量匹配的情況。生的多個肽段與同一質量匹配的情況。肽質量數鑒定蛋白質肽質量數鑒定蛋白質正交方法可分為以下幾類正交方法可分為以下幾

51、類：v1. 特異位點的化學修飾特異位點的化學修飾：肽的肽的C-末端；碘化反應，末端；碘化反應，在在Tyr上增加上增加126個單位。甲酯化，在每個羧基基團個單位。甲酯化，在每個羧基基團上增加上增加14個質量單位，如個質量單位，如Asp、Glu側鏈。側鏈。v2. 測定肽段的部分氨基酸組成測定肽段的部分氨基酸組成：A. 若肽段中可交換若肽段中可交換H在氘溶液中被交換，那么，每個氨基酸有其特定在氘溶液中被交換，那么，每個氨基酸有其特定的交換數目，每個殘基為的交換數目，每個殘基為0-5個質量單位。故肽質量個質量單位。故肽質量增加的總數就反映了肽的氨基酸組成；增加的總數就反映了肽的氨基酸組成；B. 通過鑒

52、別通過鑒別MS/MS質譜圖中的氨離子峰來確定。質譜圖中的氨離子峰來確定。肽質量數鑒定蛋白質肽質量數鑒定蛋白質v3. 鑒定鑒定N末端氨基酸殘基末端氨基酸殘基：A. 化學法化學法：Edman反應；反應；B. 酶酶法法：氨肽酶去除末端氨基酸殘基。：氨肽酶去除末端氨基酸殘基。v4. 肽內不同酶切位點的鑒定肽內不同酶切位點的鑒定：確定肽中一個特定確定肽中一個特定殘基的存在及其相對位置，采用不同酶切位點的酶：殘基的存在及其相對位置，采用不同酶切位點的酶：A. 對一級水解產物進行二次水解（次級水解）；對一級水解產物進行二次水解（次級水解）；B. 樣品分為兩等份平行水解。樣品分為兩等份平行水解。v5. 鑒定鑒

53、定C末端殘基末端殘基：用羧肽酶除去：用羧肽酶除去C末端末端 氨基酸殘氨基酸殘基，某些情況下，會有一個或多個額外的殘基被水基，某些情況下，會有一個或多個額外的殘基被水解了。但當使用高度專一的酶時，除去一個殘基不解了。但當使用高度專一的酶時，除去一個殘基不能提供太多的信息。能提供太多的信息。肽質量數鑒定蛋白質肽質量數鑒定蛋白質 決定性參數決定性參數v2. 所用酶的專一性所用酶的專一性：酶越純，專一性越高，檢：酶越純，專一性越高，檢索結果越可信。最常用的是索結果越可信。最常用的是胰蛋白酶胰蛋白酶和和LysC。 需注意的是需注意的是: (A) 即使是高純度的酶，它們即使是高純度的酶，它們仍會有漏切位點

54、，也會在非酶切位點酶切仍會有漏切位點，也會在非酶切位點酶切(其后不其后不是是Pro); (B) 不是所有蛋白質都適用于酶切不是所有蛋白質都適用于酶切, 但凝但凝膠分離的蛋白質處于變性狀態膠分離的蛋白質處于變性狀態,通常酶切十分有效通常酶切十分有效. 質譜技術在蛋白質組質譜技術在蛋白質組研究中的應用研究中的應用B. 具有翻譯后修飾的蛋白質鑒定具有翻譯后修飾的蛋白質鑒定v翻譯后修飾的方式翻譯后修飾的方式：糖基化、磷酸化、：糖基化、磷酸化、羥基化、羥基化、N端封閉等；端封閉等；v根據質譜特征峰確定修飾類型，根據根據質譜特征峰確定修飾類型，根據MS/MS確定修飾位點、甚至糖基組成、確定修

55、飾位點、甚至糖基組成、連接方式等。連接方式等。5.2.2 質譜技術在蛋白質組質譜技術在蛋白質組研究中的應用研究中的應用質譜技術質譜技術在蛋白質組研究中其他方面的應用在蛋白質組研究中其他方面的應用 確定二硫鍵的位置、蛋白質和蛋白質的確定二硫鍵的位置、蛋白質和蛋白質的相互作用、蛋白質和其他分子的相互作用、相互作用、蛋白質和其他分子的相互作用、蛋白質空間結構的初步分析。蛋白質空間結構的初步分析。5.3 其它蛋白質組研究技術其它蛋白質組研究技術 酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作酵母雙雜交系統是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。用組學研究的一種重要方法。其原理其原理是當靶蛋白和是

56、當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化后則可用于大規模蛋白質之間相術微量化、陣列化后則可用于大規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。了單雜交系統、三雜交

57、系統和反向雜交系統等。v在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體特異性結合，這被稱為應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術噬菌體展示技術。v此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用，不僅此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過

58、適當改變擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。v目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的的兩種特殊細胞系的cDNA文庫，并分離出了人上皮生文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。長因子信號傳導途徑中的信號分子。v表面等離子共振技術表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上原理

59、是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白誘餌蛋白”，當待測蛋白與誘餌蛋白結合后，薄膜的共振性質會當待測蛋白與誘餌蛋白結合后，薄膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。vSPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一實時監控。測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。核酸及其它生物大分子之間的相互作用。 v熒光共振能量轉移（熒光共振能量轉移（FRET ）廣泛用于研究分子間的距）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用離及其相互

60、作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和和RNA 的時空信息。的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發展，）的發展，FRET 熒光顯微鏡熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。受體的發射譜消除光譜間的串擾。