1、抗PTDbcr/abl單克隆抗體的制備及鑒定         11-01-31 10:11:00     作者：陳任安    編輯：studa20【摘要】  目的: 制備單克隆抗體（mAb）并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究, 為慢性粒細(xì)胞白血病的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法: 在大腸桿菌中表達(dá)PTDbcr/abl融合蛋白, 用所獲得的蛋白免疫BALB/c小鼠, 常規(guī)收集小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合, 篩選雜交瘤細(xì)胞

2、株的陽(yáng)性克隆, 并對(duì)其進(jìn)行一系列鑒定。結(jié)果: （1）表達(dá)PTDbcr/abl融合蛋白; （2）制備了抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb; （3）用mAb以多種方法檢測(cè)PTDbcr/abl融合蛋白, 證實(shí)此抗體效價(jià)高, 特異性強(qiáng)。結(jié)論: 此抗體可用于PTDbcr/abl融合蛋白的進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】  PTDbcr abl融合蛋白 單克隆抗體 制備    PTDbcr/abl是一種利用基因工程合成的融合蛋白1, 2。其中PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域）是人類免疫缺陷病毒（HIV）1所編碼的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段, 具有獨(dú)特的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式, 其特點(diǎn)是

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快, 效率高。Schwarze等3發(fā)現(xiàn)將PTD融合于相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為15×1032×105的蛋白時(shí), 可介導(dǎo)這些蛋白從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Bcr/Abl是慢性粒細(xì)胞白血病（CML）細(xì)胞中特異的bcr/abl融合基因所編碼的融合蛋白, 其Mr為21×104, 具有異常的酪氨酸激酶活性。我們以前已利用基因重組方法構(gòu)建了PTDbcr/abl的原核表達(dá)質(zhì)粒, 并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。而且證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物PTDbcr/abl融合蛋白與K562或HL60細(xì)胞共同孵育后, 可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)1。我們用純化的PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 常規(guī)

4、收集小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞融合, 篩選雜交瘤細(xì)胞株的陽(yáng)性克隆。經(jīng)ELISA、 Western blot及免疫組化方法檢驗(yàn), 證實(shí)mAb特異性強(qiáng), 效價(jià)高, 可用于PTDcr/abl融合蛋白的進(jìn)一步研究。1  材料和方法1.1  材料 大腸桿菌BL21購(gòu)自Navagene公司。表達(dá)PTDbcr/abl融合蛋白的質(zhì)粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562細(xì)胞株由本室構(gòu)建保存; BALB/c小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; 免疫組化試劑盒(鏈親和素抗生物素蛋白過(guò)氧化酶免疫組化超敏試劑盒)購(gòu)自邁新公司; 小鼠IgG亞類快速定性試紙購(gòu)于法國(guó)Arge

5、n公司; HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(由華美生物提供); 免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類試劑購(gòu)自Sigma公司。1.2  方法bcr/abl融合蛋白的表達(dá)與純化 質(zhì)粒pET16bPTD與質(zhì)粒pET16bPTDbcr/abl的制備按照文獻(xiàn)1進(jìn)行。用pET16bPTDbcr/abl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21, 取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)擴(kuò)增, 用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體, PBS懸浮, 超聲裂菌, 并用8 mol/L脲溶解蛋白, 用8mol/L脲（pH值分別是8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在NiNTAagarosePAGE電泳, 成為蛋白膠。按參考文獻(xiàn)4進(jìn)行。取蛋白膠（含蛋白1） 40 m

6、g與125 L完全福氏佐劑, 125 L PBS充分研磨后, 背部皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c 小鼠。2周后用蛋白膠（含蛋白1） 40 mg與125 L不完全福氏佐劑, 125 L PBS充分研磨后, 皮下多點(diǎn)注射, 連續(xù)3次, 每次間隔2周, 第3次免疫后14 d, 用PTDbcr/abl 純化蛋白50 g/500 L小鼠腹腔注射, 加強(qiáng)免疫1次, 3 d后取小鼠脾臟待用。取免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞按101的比例, 在500 g/L(W/V)PEG 4000介導(dǎo)下融合, 融合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基做選擇性培養(yǎng), 37、 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng), 7 d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用間接

7、ELISA法做交叉篩選。將PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一帶有His標(biāo)簽的蛋白, 文章另發(fā))(對(duì)照孔)稀釋為10 mg/L, 包被96孔酶標(biāo)板, 100 L/每孔, 4包被過(guò)夜, 次日用10 g/L BSA 120 L/孔封閉后,  分別取待測(cè)雜交瘤上清液100 L加入PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107包被板中, 4過(guò)夜; 用PBSTween20洗板5次, 加HRP羊抗鼠IgG(11000稀釋) 100 L/孔, 37、 1 h; PBSTween20洗板5次, TMB顯色; 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。置酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量A值, A450值大于陰性對(duì)照孔2.1倍以上為陽(yáng)性, 選取PTDbcr/abl融合蛋白陽(yáng)性而HisTaxreb107陰性的孔細(xì)胞, 采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆, 至所有雜交瘤上清液均呈陽(yáng)性為建株標(biāo)準(zhǔn)。每只BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注入0.5 mL液體石蠟, 1周后將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi), 5×106雜交瘤細(xì)胞/只。大約710 d后收集腹水, 按常規(guī)經(jīng)飽和硫酸銨鹽析、 ProteinG親和層析進(jìn)行純化。用紫外分光光度法測(cè)定其濃度, 加入終濃