1、抗體選擇指南抗體保存指南抗體說明書樣本一抗體選擇指南:檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體,需要考慮如下幾種因素:1. 分析或應用的類型2. 樣本蛋白的結構性質3. 樣本的種屬4. 抗體宿主的種類5. 抗體的標記和檢測1分析試驗的應用類型一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種分析類型,如:可以應用于WB IHC ICC ELASA分析等,如果抗體說明書沒有提及的應用類型,并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型,而僅是說明尚未經過此種分析試驗驗證,如果抗體不適用某些分析試驗,則會在抗體說明書上標注出來不適于某分析試驗。2 樣本蛋白的結構性質了

2、解樣本蛋白的結構性質有助于選擇最合適的抗體,至少兩方面因素需要考慮(1.待測樣本蛋白的結構域:抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來,其中的免疫原包括:全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體(如:細菌或細胞,抗體說明書一般都有免疫原的描述,如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區域,則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白,則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。(2樣本的提取或處理過程:某些抗體要求樣本經過某些特殊處理,例如:許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本,另一方面,某些抗體僅識別天

3、然折疊狀態的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時,應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織,而另一些抗體則適用于無需抗原修復解交聯步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織,這些都會在抗體說明書上應用部分標示出來3 樣本的物種應選擇物種相同或有交叉反應的抗體,抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應,因其氨基酸序列同源性較高,如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中,并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白,而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過,應通過序列比對的方法來預測交叉反應,可應用Expasy 和 NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。4 一抗宿主物種的選擇一般說來,在使用偶聯二抗結合無

4、偶聯物的一抗時,一抗宿主動物的物種選擇較為重要,對于免疫組化而言,盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗,從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生交叉反應,例如:檢測小鼠樣本蛋白,則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗,最好選兔源的一抗,則二抗則可選擇偶聯了檢測分子(酶、熒光素、生物素等的抗兔IgG。如果選擇有偶聯物的一抗則不適用上述情況,除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法,則抗體宿主物種的影響不大,如對不含IgG的細胞裂解物樣本的western blotting 檢測,盡管如此,含有血清的組織裂解物和組織培養上清中含有免疫球蛋白,還原變性樣本中含IgG,在western blot檢測中則

5、結合出現IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。5 二抗的選擇二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源,例如:如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說明書確保該抗體適用于你的檢測應用,二抗一般連接熒光素FITC或發光團。6 雙重染色抗體的選擇用未偶聯一抗進行細胞培養物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來源于不同物種并且二抗分別識別其中之一,二抗說明書應描述其與其它物種來源的免疫球蛋有否有交叉吸附。7熒光和化學發光標記連接于二抗的標記物是為了檢測抗體的結合,選擇標記物依賴于幾個參數:檢測方法:熒光或著色沉淀,熒光標記物用

6、特殊波長的光激發時發射出可見光,下表列出了幾種熒光素的分子特征:熒光素顏色激發波發射波長分子量Aminomethylcoumarin (AMCA Blue 353 440 410Fluorescein (FITC Green 495 528 390Fluorescein (DTAF Green 495 528 530Rhodamine (TRITC Red 550 570 444Texas Redtm Red 596 620 625Cy2tm Green 489 505 897Cy3tm Orange 552 565 949Cy3.5tm Scarlet 581 596 1,286Cy5tm

7、Far-Red 650 667 975Cy5.5tm Near Infra-Red678 703 1,312Cy7tm Near Infra-Red743 767 1,001R-Phycoerythrin (RPE Red 488 575 240,000B-Phycoerythrin (BPE Red 545 575 240,000C-Phycocyanin Red 618 640 110,000R-Phycocyanin Red 615 620 110,000二抗連接標記酶HRP and AP 與其底物產生有顏色的沉淀物 辣根過氧化物酶Horseradish peroxidase (HRP

8、堿性磷酸酶Alkaline phosphatase (APAEC (red Fast red (pink DAB (brown INT (yellow / brown NBT (brown / purple New Fuchsin (red TNBT (purple Vega red (pink封片介質(僅免疫組化. AEC, Fast Red, INT 或其它水性發光基團是可以醇溶的并要求水性封片. 除上述之外的發光基團是有機的所以最好使用有機性封片介質。熒光素標記物要求水性封片介質,藻紅蛋白(藻青素 / 藻紅素要求不添加甘油的水性封片介質,因其有淬滅熒光的效應,生物素化的抗體通常用于加強親

9、和素-生物素-酶或熒光素復合物(ABC 試劑 或親和素或鏈霉親和素連接酶或熒光素的信號 封片介質抗體保存指南抗體保存得當與否,直接決定了抗體的活性和使用效果!如果抗體保存得當,大部分抗體活性都可以維持數月甚至數年。本指南以abcam抗體保存方法為主,同樣也可以應用到其他絕大部分公司的抗體產品!請謹記!無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體!1. 收到抗體后請務必在12000rpm離心20-30s后再打開管蓋進行分裝和保存!質優的抗體使用非常特殊的儲存管,只有在12000rpm離心20-30s才能將附著在管壁或蓋內的抗體全部離心下來。即使是在10000rpm離心也會導致離心不完全,導致出

10、現抗體的量不足的現象!o 2. 對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在 -20度 or -80度對絕大多數抗體來說,保存在-20度是完全足夠了。沒有任何證據顯示保存在-80度 會有更多的好處!o分裝可以最大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害,同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。o分裝的量以一次實驗用完為好,最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響o復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4度,避免再凍起來!o抗體工作液應該當天配制當天用完,在4度 盡量不要超過1天。o絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。盡量將

11、抗體保存在冰箱里層,而不是門上3. 大部分抗體收到后4度短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。如果抗體很快(1-2周會使用,推薦在4度保存,這是為了避免反復凍融對抗體活性的損害。如果要長期保存則最好是在-20度 or -80度。最關鍵的一點是要根據說明書推薦的方式來正確的保存抗體!但是,腹水形式的產品請在收到后立即凍起來!因為該類產品含有大量的蛋白酶,長期在4度保存會導致抗體的降解!4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過程需要1-2周的時間,所以是在4度的條件下來完成的。4度運輸最主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害(如果使用干冰運輸,那么收到時抗體是凍起來的,為了分裝就需要解凍。

12、這就多了一次凍融的過程。所以運輸過程中絕對避免干冰運輸!特殊抗體的保存條件:1.酶聯抗體:永遠保存在4度,避免凍起來。否則會導致酶活性的下降或者喪失2.偶聯抗體:所有偶聯抗體都是在棕色管中或使用錫箔紙避光保存。尤其是熒光抗體,對光極為敏感,因此在所有的實驗階段也是要避光操作的!3.IgG3的同型對照:永遠保存在4度,避免凍起來。因為如果出現凍融過程,該抗體非常容易形成多聚體無論是保存還是運輸,絕對避免反復凍融!反復凍融會導致抗體變性,導致多聚體形成,從而降低抗體的結合能力!抗體保存其它相關信息:關于加入甘油保存:有些人會加50%的甘油到抗體中來避免反復凍融,甘油在-20度 會降低冰點。這對很多

13、抗體可能是可行的。但是abcam僅對非常小的一部分抗體檢測過其在這種條件下的穩定性;而abcam只對按照推薦條件保存的抗體提供質量保證!加入甘油的溶液不建議在-80度保存,因為這已經超過了甘油的冰點。如果您要加入甘油來保存抗體的話,請謹慎注意無菌操作,避免污染!關于蛋白保護劑:蛋白在高濃度時更不容易降解(1 mg/ml 或者更高,這就是為什么在抗體中加入BSA之類作為穩定劑的原因了;另一方面,加入的蛋白也可以減少抗體由于管壁吸附所造成的損失。但是如果抗體要用來標記的話,則不能加入蛋白穩定劑,因為這些穩定劑會和抗體一起競爭結合標記物。關于疊氮化鈉(sodium azide的使用:為了防止微生物污

14、染,疊氮化鈉經常被加入到抗體中(終濃度0.02% (w/v。Abcam的很多抗體已經含有了0.02%-0.05%的疊氮化鈉,在說明書的“Storage buffer”中有標明的。在下述情況中不能使用疊氮化鈉:如果抗體用于染色或處理活細胞,用于體內研究:疊氮化鈉在抵抗微生物的同時,對其它大部分有機物也是有毒的,因為它阻斷了線粒體的cytochrome electron transport system.要偶聯帶有氨基基團的抗體:疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團的偶聯,因此在進行偶聯之前,應將疊氮化鈉去除。偶聯后的抗體可以加入疊氮化鈉保存,但是濃度只能是0.01%。對于需要偶聯的抗體,thimero

15、sal (merthiolate可以替代疊氮化鈉作為保護劑!注:疊氮化鈉的去除方式:可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除!IgG的分子量是150kDa (IgM 是 600kDa; 疊氮化鈉的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除抗體說明書樣本 Product Name Product type Description Immunogen Reacts with Specificity Tested applications Application notes NFkB p105 / p50 antibody E381 Primary antibodie

16、s 一抗 (注:E381 是指克隆號 Rabbit monoclonal E381 to NFkB p105 / p50 A synthetic peptide corresponding to residues in the nuclear factor NFkB p50 subunit. Hu, Ms, Rat (注:人 小鼠 大鼠 This antibody will detect both forms: p50 and p105. Flow Cyt, ICC, IHC-P, WB(流式細胞分析 學-石蠟包埋 western bloting 免疫細胞化學 免疫組織化 Recommende

17、d dilutions Flow Cyt: 1/30. ICC: 1/250 - 1/500. IHC-P: 1/250 - 1/500. WB: 1/5000. Detects bands of approximately 50 and 105 kDa (predicted molecular weight: 50 and 105 kDa. Is unsuitable for IP. Not yet tested in other applications. Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end us

18、er. Positive control Cellular localization HeLa cell lysate; human prostate carcinoma Nuclear, but also found in the cytoplasm in an inactive form complexed to an inhibitor (I kappa B. Research areas Cancer >> Signal transduction >> Nuclear signaling >> NFkB pathway Chromatin >&

19、gt; Transcription >> Transcription Factors Nuclear Signaling >> Nuclear Signaling Pathways >> NFkB pathway Nuclear Signaling >> Transcription >> Other factors Cell Biology >> Signal Transduction >> Nuclear Signaling >> NFkB Pathway Immunology >>

20、Innate Immunity >> Macrophage / Inflamm. Cell Biology >> Apoptosis >> Intracellular >> NFkB >> p50 Relevance NFkB is a transcription regulator that is activated by various intra and extra cellular stimuli such as cytokines, oxidant free radicals, ultraviolet irradiation

21、, and bacterial or viral products. NFkB is a family of transcription factors that consists of homo and heterodimers of NFkB1/p50 and RelA/p65 subunits, and controls a variety of cellular events including development and immune responses. All members share a conserved amino terminus domain that inclu

22、des dimerization, nuclear localization, and DNA binding regions, and a carboxy terminal transactivation domain. Serines 529 and 536 in the transactivation domain of RelA/p65 are phosphorylated in response to several stimuli including phorbol ester, IL1 alpha and TNF alpha as mediated by IkB kinase a

23、nd p38 MAPK. Serine 529 is located in a negatively charged region (amino acids 422-540 that is phosphorylated in response to phorbol myristate acetate plus calcium ionophore activation. Phosphorylation of serines 529 and 536 is critical for RelA/p65 transcriptional activity. Activated NFkB transloca

24、tes into the nucleus and stimulates the expression of genes involved in a wide variety of biological functions. Inappropriate activation of NFkB has been associated with a number of inflammatory diseases while persistent inhibition of NFkB leads to inappropriate immune cell development or delayed ce

25、ll growth. Alternative names for NFkB p105 / p50 antibody E381 (ab32360 Database links The links below go to external sites and will open in a new browser window Entrez Gene 4790 (Human 18033 (Mouse 81736 (Rat GeneCar d Omim GC04P103880 (Hum an 164011 (Human Unigene SwissPr ot P19838 (Hum an P25799