1、紙層析法一一氨基酸的分離與鑒定6實驗目的1、了解紙層析法的使用原理。2、掌握用紙層析法分離蛋白質(zhì)的操作步驟。實驗原理1、紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析方法，濾紙上的纖維具有羥基，是親水基團，濾紙吸附水作為固定相，其上流經(jīng)的有機溶劑即展層劑作為流動相。當展層劑流經(jīng)固定相時，固定相上的樣品由于親水、疏水能力不同，在兩相之間不斷分配，疏水能力強的多溶于流動相，隨流動相移動距離較遠，親水能力強的移動距離則較近。2、所有的氨基酸的a碳上均連接一個氫原子和兩個親水基團竣基（一COOH）與氨基（一NH2）,唯一的不同則在于R基團。因此R基團在氨基酸的親水疏水能力對比中起到了決定性的作用。本實驗采用

2、丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基團分別是一CH3,一C»C6H5,-CH2-COOHI,其親水疏水能力迥異，能在濾紙上明顯分開。3、Rf值表示原點中心至顯色斑點中心的距離與原點中心至流動相前沿的距離比。在一定條件下，Rf值為定值，其影響的因素有物質(zhì)本身的性質(zhì)，溶劑的性質(zhì)，PH值，溫度，濾紙的性質(zhì)等等，本實驗不予探究。在測量原點中心至顯色斑點中心的距離時，由于斑點的形狀不規(guī)范（近似圓形），所以，一般取斑點的重心，測量出重心與起點的距離即可。原點到層析點中心的距離X原點到溶劑前沿的距離紙層析中Rf=X/Y4、顯色原理：苛三酮在弱堿性溶液中與a氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氧，脫竣反應,最

3、后苗三酮與反應產(chǎn)物一一氨和還原苗三酮發(fā)生作用生成紫色物質(zhì)。（一）提前配制試劑8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精確稱取0.356g晶體，溶解后定容到500ml。8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精確稱取0.661g晶體，溶解后定容到500ml。（將上述三種8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精確稱取0.532g晶體，溶解后定容到500ml。溶液裝于小瓶中實驗時，每兩組共用一組試劑）正丁醇88%甲酸蒸餾水茚三酮晶體注：實驗時，以上試劑均為每兩組同學共用一組試劑。（二）當堂配制試劑丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:將上述溶液等體積混合即可4、 實驗儀器每組：鐘罩：1試管：15mm*10cm*5

4、試管架：1培養(yǎng)皿：95mm*1移液管：10ml*1洗耳球：1小燒杯：25ml*2濾紙：15cm*15cm鉛筆：1（可以用其他小規(guī)格的燒杯如20,10,8ml的代替）100ml*1*1直尺：1毛細吸管：4保鮮膜：1細玻璃棒：1公用：酒精燈：3訂書機：3稱量紙：若干烘箱：1量筒：100ml*1薄膜手套：若干5、 操作步驟（一）展層劑和平衡溶劑的配制1 在100ml燒杯中按照體積比正丁醇：88%甲酸：蒸餾水=15：3：2的比例配制展層劑，建議為45ml：9ml：6ml。2 稱取0.05g茚三酮晶體，并用玻璃棒攪拌溶于展層劑中，蓋上培養(yǎng)皿。3 平衡溶劑與展層劑相同。（二）點樣1 實驗臺上鋪好保鮮膜，保

5、鮮膜下面可以蘸少量水，使得保鮮膜能與實驗臺面緊密貼合，此后所有操作都在保鮮膜上進行，不再贅述。2 在距平行于15cm長的邊2cm處用鉛筆輕輕描出一條直線，此為展層起點線，在直線中間每隔3cm用鉛筆輕輕點一個點，共點四個點。再在另一邊，距邊緣1cm處用鉛筆輕描出一條直線，此為展層終點線。3 .將毛細管的一端在酒精燈外焰上灼燒36s,毛細管管口變細即可。4用毛細管分別蘸取三個氨基酸標準液和氨基酸混合液，點樣于展層起點線的四個點上。點完一次后，用電吹風冷風吹干，再點第二次樣。每次點樣均要求斑點半徑。5在標準樣下面用鉛筆做好標記，記錄該點的氨基酸名稱。（三）平衡及展層1 將點好樣的濾紙兩側(cè)邊緣對齊但不

6、接觸，卷成筒形，并用訂書機訂34次，將圓筒固定。點樣后的濾紙卷成筒狀的濾紙2 .將圓筒豎直放入培養(yǎng)皿中，濾紙勿與皿壁接觸，皿周圍放2個25ml小燒杯，內(nèi)盛平衡溶液10ml左右，蓋上鐘罩，平衡半個小時。3 .用移液管吸取10ml展層劑，打開鐘罩上的塞子，將移液管下端盡量伸進培養(yǎng)皿底部，將展層劑加入到培養(yǎng)皿中，拿出移液管。添加30ml展層劑，塞上鐘罩塞子。4 .展層約兩個半小時，當溶劑前沿至展層終點線時，取出濾紙。（四）顯色及R值計算1.將取出的濾紙用電吹風冷風吹干，并放入65c左右的烘箱中烘10min。1 ,取出烘完的濾紙，估計出斑點的重心，共六個點（三個標準液，三個由混合液分離出），并用鉛筆輕

7、輕點出。3 .展層劑跑的距離do=12cm,用直尺測量出斑點中心到展層起點線的距離did6,計算Rfx=（x=1,26）4 .將混合樣分離出的斑點的R值與標準樣的進行對比，從而認清各斑點的氨基酸種類，并在濾紙上標明。六、注意事項1 .實驗全程戴一次性薄膜手套，全套實驗在鋪在實驗臺上的薄膜上進行。原因：人的皮膚上含有含氮化合物，而實驗臺上可能未洗干凈殘留其他氨基酸，會沾染到濾紙上，對實驗產(chǎn)生影響；保鮮膜可以與鐘罩邊緣進行更緊密的結(jié)合，是平衡效果更好。2 .用毛細吸管進行點樣時，為保證點樣半徑足夠小，應使毛細管內(nèi)的液體高度低于1cm,迅速的點在濾紙上。若管內(nèi)液體過高，可以先將毛細管的液體點一部分于干凈的衛(wèi)生紙上，降低管內(nèi)液體高度。3 .在