1、第31卷第10 期環境科學2010 年 10月ENVIRONMENTALSCIENCEVol. 31，No. 10Oct. ，2010hVDR 原核表達及其與重金屬鎘、鉛的結合活性焦健1，2 ，2* ，2 ，1張照斌胡建英王金水（1. 河南工業大學糧油食品學院，鄭州450052 ；2.北京大學城市與環境學院，北京100871 ）摘要 ：人類維生素D 受體 （hVDR ）是重金屬影響骨骼代謝的潛在受體通道，但目前沒有重金屬影響hVDR 通道的報道. 通過構建含有 hVDR 的 pGEX- 4T- 1 表達質粒 ，建立了原核表達具生物學活性的hVDR 的方法 ；然后根據核受體與其配體結合后可以與核

2、受體轉錄激活因子2（Transcriptionalintermediaryfactor 2 ，TIF2 ）- 細菌堿性磷酸酶（bacterial alkalinephosphatase，BAP ）融合蛋白 （TIF2- BAP ）結合 ，建立了研究化學物質影響hVDR 與核受體轉錄激活因子結合活性的磷酸對硝基苯酚法. 通過該方法研究發現 ，鎘（CdCl 2 ）或鉛 （PbAc 2）均能提高hVDR與 TIF2- BAP 的非配體依賴性結合. 當加入 100mol / L 和 1 000mol / L 氯化鎘（CdCl），3. 95和4. 39倍（p 0. 05 ）；100 mol / L和1

3、000 mol / L醋 酸鉛2后 結合活力分別顯著上升至對照組的加 入（PbAc 2 ）后，結合活力分別顯著上升至對照組的2. 29和3.52倍（p 0. 05 ）. 這表明鎘和鉛可能通過干擾hVDR 受體通道的正常功能導致骨代謝異常和骨質疏松癥的發生.關鍵詞 ：人維生素D 受體 ；原核表達 ；重金屬 ；結合效應 ；鎘；鉛；骨代謝中圖分類號：X18文獻標識碼：A文章編號：0250- 3301 （2010 ）10- 2469- 06ProkaryoticExpressionof HumanVitaminD Receptor（hVDR ）and ItsBindingActivitiestoCda

4、ndPbJIAO Jian1，2 ，ZHANGZhao- bin 2 ，HUJian- ying 2 ，WANG Jin- shui 1（1. School ofFood Science andTechnology，HenanUniversityof Technology ，Zhengzhou 450052 ， China；2. College of Urban andEnvironmentalSciences，PekingUniversity ，Beijing 100871 ，China ）Abstract：HumanvitaminD receptor （hVDR ） is a potent

5、ial receptor channelfor heavy metals to affect bone metabolism ，while to datethere is no report about the bindingactivitybetween heavy metals and hVDR.This study established a prokaryotic expression of hVDRsystem，by cloned hVDR- LBD into pGEX- 4T- 1 vector.Then accordingto the principlethat the nucl

6、ear receptor bindingwith its ligandcan be combinedwith nuclear receptor coactivator 2- bacterial alkalinephosphatasefusion protein （TIF2- BAP ）， weestablished amethod of p-nitrophenylphosphate- alkalinephosphatase to analyse the effectsofchemicalonthe bindingactivity between hVDR andTIF2- BAP.Using

7、this method，we studiedthe bindingactivitiesbetween hVDRand TIF2- BAP after exposure of cadmiumand lead.The results showed that the bindingactivitiessignificantlyincreased to 3. 95and 4. 39 timesthat of thecontrol after exposure of 100mol / Land 1 000mol / L cadmiumchloride（CdCl 2 ），and the binding a

8、ctivities significantlyincreased to 2. 29 and 3. 52times thatof the controlafter exposureof100mol / L and 1 000mol / L leadacetate（PbAc2）， respectively.These resultsindicate thatcadmium and lead can mimicthe activity of 1，25- （OH ）2 D 3 ，disrupt the normalfunctionof hVDR receptor channel ，which may

9、be theunderlying mechanism of abnormalbone metabolism and osteoporosis caused by cadmium and lead.Key words ：humanvitaminDreceptor （hVDR ）；prokaryoticexpression；heavymetals ；combiningeffect ；cadmium ；lead ；bonemetabolism，目前 重金屬的污 染已成為 影 響人類健康的重要因素 . 許多疾病的高發被懷疑與重金屬污染有關，但是其分子機制卻并不清楚.鎘和鉛是2 種重要的重金屬污染元素，

10、可以導致多種人體疾病其中由其引起的佝僂病、軟骨病 、骨質疏松癥 、骨骼畸形和骨骼代謝異常是最受關注的公共健康問題之一.20“痛痛 病”世紀八大公 害之一的就是由于長期食用被鎘污染的大米而引起的，該病典 型生理學特點之一便是骨密度降低引起骨質疏松. 最近 ，全球各國的大量流行病學調查進一步證明了鎘、鉛污染的增加與骨密度的降低存在顯著1為了模擬和的相關性 .證實人體暴露 鎘 引起 的流 行病效 應，Brzoska 等2 ，3開展了飲水添加鎘暴露老鼠實驗，發現長期暴 露 1mg / L 鎘就 可以導致老鼠腰椎骨質疏松癥、骨質軟化、硬度降低 、骨骼代謝異常等. 同樣 ，對鉛污染與骨密度的流行病調查也得

11、出了相似結論，發現長期從事接觸鉛的工作也可以導致骨密度明顯降低，接觸鉛的時間與骨鈣密度值呈顯著負相關4. 世界衛生組織的大量調查和實驗也證實了鉛會降低骨鈣含量并影響骨骼發育 5.收稿日期：2009- 11- 24 ；修訂日期：2010- 01- 16基金項目：國家自然科學基金項目（20877003 ，20837003 ）作者簡介：焦健 （1984 ），男 ，碩士研究生，主要研究方向為糧食、油脂與植物蛋白工程，E- mail ：jiaojian1111yahoo. com. cn*通訊聯系人，E- mail ：zhangzb pku. edu. cn2470環境科學31卷以前，一般認 為鎘和鉛導

12、致骨質疏松癥、骨骼代謝異常等疾病的原因是由于其在腎臟皮質中的大量貯存 ，降低了腎臟中負責將 25- 羥基維生素 D （25-OHD 3）催化 為 活性維生素 D1 ，25-（OH ）2D3 ，或 稱骨化三醇 的腎 1 羥 化 酶活 性，使 1 ，25- （OH ）2 D3生成減少，血液中1，25- （OH ） D濃度降低，從而引23起成骨細胞 活性下降，產生的基質減少，使骨量降低，最終導 致 骨 質 疏 松癥 發 生 4，6. 最 近 ，Engstrom7 等通過酶聯免疫分析了不同鎘暴露水平絕經婦女的血液1，25-（OH）D濃度，否定了鎘通過影響23血液 1，25-（OH）2D3 水平導致骨質

13、疏松的說法. 他們的研究發現 ，盡管鎘 與骨密度 等 相關骨骼指標存在顯著相關性，但是鎘污染水平與血液1，25-（OH ）2 D3濃度沒有顯著相關性，且血液 1，25-（OH ）2D3濃度與骨骼指標也沒有相關性 . 這樣鎘 、鉛導致骨質疏松和骨骼代謝異常的機制仍不清楚，有待進一步研究.鑒于一些研究表明，鎘可以與含羥基、氨基、，巰基的蛋白質分子結合 從而抑制許多酶的活性 8. 而 1，25-（OH ）2D3 發揮生理功能的通道是維生素D9受體（VDR），也是含羥基、氨基、巰基的蛋白質. 且有研究表明hVDR 與腸道鈣吸收、骨質代謝相關10 14 . 因此 建立 體 外 研究 hVDR受體活性的方

14、法，開展重金屬與hVDR 的受 體結合 活性分析，對于闡 明鎘、鉛導致骨質疏松和骨骼代謝異常的機制具有重要的意義.1 材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 質粒 、細胞株質粒pGEX- 4T- 1、菌株 E. coli DH 5 購自北京鼎國生物 技 術 有 限 公 司 . 含 有 重 組 質 粒 PET28a -TIF2-BAP 的 BL- 21 菌株獲贈于日本大阪大學藥學院西川淳一教授.1. 1. 2 主要試劑二甲基亞砜，卡那霉素，氨芐青 霉 素，IPTG ，溶菌酶 Lysozyme，顯色劑 （p-nitrophenylphosphoricacid ，NPP），還原型谷光苷肽，DTT ，

15、Nonidet P-40 （reagentgrade）， EDTA （BiotechnologyGrade ）， Tween20（Biotechnology Grade）均購自 美國 Amresco 公司 ；親和 吸 附 填 料 Glutathione Sepharose 4B 購 自 瑞 典自 TaKaRa 公司 ；1，25- （OH ）2 D 3 購自南京康滿林化工實業有限公；、醋酸鉛購自上海亭新制司 氯化鎘藥廠 .1. 1. 3 測試樣品的配制1，25-（OH）2D3 先用異丙醇配成終濃度為 0. 1 mol /L 的 儲 備 液，然 后 按 照 10 倍 稀 釋 的 方 法 用DMSO

16、稀釋 7 個梯度. 氯化鎘、醋酸鉛用去離子水配成 0. 1 mol / L 的儲備液 ，然后按照 10 倍稀釋的方法用去離子水梯度稀釋.1. 2 方法1. 2. 1pGEX- 4T- 1 VDR- LBD 表達載體的構建利用 Trizol 法提取Caco-2 細胞總RNA ，反轉錄得到 cDNA ，根 據 目 的載 體的 酶 切位 點分 別設計 引物， 上 游： 5-CCCGGAATTCGATTCGAAGGAGT-TCATTCTGACAGATGA-3，下劃線為EcoR 酶 切位點；下 游：5CGATAAGCTTGATTTCAGGAGATCT-CATTGCCAA- 3，下 劃 線為 Hin d

17、酶 切 位 點 . 反 應條件為 ：94 5 min ，94 30 s，54 30 s，72 45s，共 35 個循環，72 延伸 10 min. 回收PCR 產物 ，用 EcoR 和 Hin d 酶 切 VDR- LBD 片段 ，TaKaRa膠回收試劑盒回收酶切后產物. 再用 T4DNA 連接酶連接 VDR- LBD 和 pGEX- 4T- 1，轉化至 DH 5 感受態大腸桿菌中 .1. 2. 2 GST-VDR- LBD 、TIF2- BAP 重組蛋白的表達及純化從轉化平板上挑取單菌落 ，接入 20mL 含 100g / mL 氨 芐 青 霉 素 （PET 28a - TIF2- BAP菌

18、用 25g / mL 卡那霉素 ）LB培養基中 ，37 260r / min 培養過夜，按 2 %的比例轉接到新鮮的 LB培養基.37 培養至對數生長期（D595 為 0. 40.6 ），加入 1mmol / L IPTG 誘導表達. 3h 后 ，43 600r / min 離心10 min ，收 集 菌 體 . 菌 體 用 30 mL B 1 緩 沖 液 （20mmol / L Tris（pH 7. 5），10%glycerol ，0. 1 mol / LKCl ，5 mmol / LMgCl2 ）重 懸，80 冷 凍 8h，加 1mg / mL 溶菌酶冰上消化20 min ，冰浴超聲 破碎

19、 后轉移到三角瓶中，并加入0. 05 mol / L KCl ，冰浴攪拌 30min. 4 ，9 000r / min 離 心 20min ，收 集 上 清 . 用sepharose 4B分離純化GST-VDR- LBD蛋 白； Ni-用agarose 分離純化TIF2-BAP 蛋白. 所得蛋白經 SDS-PAGE 電泳分析，確認純化效果后80 保存備用 .Amersham 公 司，Ni- NTA agarose 購 自 Qiagen 公 司；1. 2. 3 受體結合測試實驗酵 母 提 取 物，胰 蛋 白 胨 購 自 英 國 Oxoid 公 司，參照 Kanayama 等15 開發的磷酸對硝基

20、苯酚法Pyrobest DNA 聚 合 酶、Xho 、EcoR 、T4DNA 連活力測試系統的方 法，取 0. 3 mg GST-VDR- LBD 蛋接酶以及 DNA 膠回收試劑盒 、質 粒提取試劑盒 購白溶 于 10 mL 冰 冷 的0. 1 mol / L NaHCO 3 （pH =10 期焦健等 ：hVDR 原核表達及其與重金屬鎘、鉛的結合活性24 718. 4）溶液中 ，加入預冷的 96 孔酶標板上 ，每孔加入100L ，4 放置8 h. 用 200 L 的緩沖液A- DTT （先加20 mmol / LTris- HCl ，100mmol / LKCl ，0. 25mmol / L

21、EDTA ，5% Glycerol ，調節 pH 為7. 4 ，然后加0. 05% Tween 20 ，形成緩沖液 A ，配制 1mol / L DTT ，用前混合使其最終濃度為0. 5mmol / L，形成 A- DTT緩沖溶液 ）清洗3 次.每孔加入100 L TIF2- BAP 溶液（3 gTIF2- BAP 溶于 冰冷緩 沖液 A- DTT 中），每孔加入 1L 1，25- （OH ）2 D 3DMSO 溶液或氯化鎘、醋酸鉛待測試樣品，4 放置60 min. 用 180 L 冰冷的緩沖液B （先加50 mmol / L Tris- HCl ，100mmol / LKCl ，5 mmol

22、 / L MgCl 2 ，調節 pH 為 7. 2 ，然后加0. 1%Nonidet P-40 ）清洗3 次. 每孔加入100 L 顯色緩沖液在 1mol / L Tris- HCl （pH8. 0）中加入 NPP，使其最終濃度為10 mmol / L，輕 輕 混 勻 ，37 放 置 60min. 加入 25L 0.25 mol / L NaOH 終止反 應，在 酶標儀上 405 nm 波長測定吸光度值.1. 2. 4 統計分析采用 SPSS 軟 件 （Ver11. 5；Chicago，IL ，USA ） one-way ANOVA ，Tukey 多重比較來檢驗相關數據的差異 ，當 p 0.

23、05 時認為差異顯著 ，所有數據和圖表均以平均值 標準偏差表示 .2 結果與討論2. 1 受體結合活性方法建立（1） GST- hVDR 重組蛋白的表達與純化電泳結果表明 ，經過 IPTG 誘導后 ，GST-hVDR- LBD 蛋白明顯表達 .如圖 1 所示，在第 2 泳道相對分子質量58 103 80 103處出現明顯的誘導蛋白條帶，與設計的相對分子質量為 62 10 3 GST-hVDR 重組蛋白相吻合 . 經 sepharose 4B 柱分離純化后 ，得到單一的經誘導后出現的蛋白條帶（圖1第3泳道），表明本研究建立的含有VDR- LBD 插入片段的pGEX- 4T-1表達載體轉染大腸桿菌

24、后可以成功表達 GST-hVDR蛋白，sepharose 4B柱很好分離并且可以經過純化 .（2） hVDR 結合活性的磷酸對硝基苯酚法在人類或動物機體內，核受體VDR 是 1 ，25- （OH ）2 D3發揮生物學活性的通道 ，VDR 與 1，25- （OH ）2 D3 結合后形成受體配體復合物，進而能 夠與轉錄共激活因子結合 ，從而可以結合RNA 聚合酶 啟動 VDR調控目標基因的轉錄. 因此 ，受體配體復合物與轉錄共激活因子的結合能力被認為是反映VDR 啟動基因轉錄活性的重要指標. 本研究正是基于這個原理，M. 蛋白質分子量Marker ；1. 未誘導的BL21 /pGEX- 4T- 1

25、- hVDR- LBD裂解物；2. IPTG 誘導3 h 的 BL21 / pGEX- 4T- 1- hVDR- LBD 裂解物；3. 純化后 hVDR- LBD 融合蛋白圖 1 大腸桿菌表達的GST- hVDR 重組蛋白及柱純化后的電泳圖Fig. 1SDS- PAGE result of recombinantproteinpGEX- 4T- 1- hVDR- LBDafter purification參照 Kanayama 等 15 開發的CoA- BAP 測試系統，選用核受體轉錄共激活因子TIF2 ，建立測定化學物質與 hVDR 結合活性 的磷 酸對硝基 苯 酚法 . 在該 方法中，TI

26、F2 蛋白的 C 末端連接堿性磷酸酯酶（BAP），形成 TIF2-BAP 融合蛋白. 而 BAP 能夠將顯色劑NPP（p-Nitrophenylphosphate ）的磷酸基團切去，變為黃色的 p-Nitrophenol ，在酶 標 板 405nm波長下可測定 . 因而配體的 VDR 結合活性同顯色強度有著相關關系 ，從而可以利用顯色強度表征化學物質與VDR的結合活性 （見圖 2 ）.圖 2hVDR受體與TIF2結合顯色反應流程示意Fig. 2Scheme of screeningmethodfor hVDRligands2472環境科學31卷本實驗采用上述方法，開展 1，25-（OH）2D3

27、 與 hVDR- LBD 的 結 合 實 驗，發 現 隨 著 1 ，25- （OH ）2 D3 濃度的改 變 ，405 nm 光 吸收 值相應 升 高，且 1 ，25-（OH ）2 D 3 在 1 nmol 水 平時，光 吸 收 值 就 有 明 顯 升高，說明該方法靈敏有效 （圖 3）.B：1 ，25- （OH ）2 D3 相應濃度下與受體VDR 的結合活力；B 0：1，25- （OH ）2 D 3 最大測試濃度（10 6 nmol / L ）時與受體 VDR 的結合活力；B /B 0 ：相對活力圖 31，25- （OH ）2 D 3 與受體hVDR 的結合曲線Fig. 3Binding cu

28、rve of 1 ，25- （OH ）2 D3 and hVDR2. 2 重組蛋白 hVDR- LBD 與鎘 、鉛的結合活性利用上述 方 法 進 行 氯 化 鎘 （CdCl 2 ）、醋 酸 鉛（PbAc 2 ）的暴露實驗. 當加入濃度為 100mol / L 和1 000 mol / L CdCl 2時，（p 光吸收值顯著升高0. 05），分別達到對照組（DMSO）的 3. 95 和 4. 39 倍 . 當 加 入 100 mol / L 和 1 000 mol / L PbAc 2 時，結合活力同樣顯 著升 高 （p 0. 05 ），分 別達 到對 照組（DMSO）的 2. 29 倍和 3.

29、 52 倍（圖 4）. 由此可見鎘、鉛的存在對 hVDR 的 構象 造成 了 明顯 影響 . 在濃度達到一定程度后，其可以使hVDR 在沒有1，25-（OH ） D存在情況下與核受體共激活因子TIF2 結23合，獲得開啟下游基因表達的活性，從而擾亂 VDR的正常通道功能，進而干擾受 hVDR 通道 調控的 骨骼代 謝 等 生 理 活 動 . 這 與 以 前 一 些 有 關 CdCl 2 、 PbAc 2 與雌激素受體 （estrogen receptor ，ER ）和雄激素受體 （androgen receptor ，AR ）結 合的 報道 結果 相似 . Wilson 等16 通 過 克 隆

30、 雌 激 素 受 體 反 應 元 件（estrogen-responsive elements， ERE ）到 人 乳 腺 癌T47D 細胞 ，體外構建了基于熒光素酶報告基因的雌激素受體-配體結合實驗系 統，發 現重金屬鎘在0. 1mol / L及更高濃度時就具有類雌激素作用，而且當加入 1 mol / L雌激素受體拮抗劑ICI- 182780 時 ，結合效應完全被抑制 ，因此認為重金屬是通過與雌激素受體 （estrogen receptor ，ER ）結合調控相關基因的17 轉錄產生雌性化效應. Martin 等開展的重金屬與雄激素受體 （androgen receptor ，AR ）結 合

31、實 驗 也 得到類似結果，他 們發 現在 濃 度 達到 0. 01 mol / L 時能夠完全干擾雄激素雙氫睪酮（DHT ）與 AR 的正常結合 . 鑒于 ER 、AR 與 VDR 都屬于核受體超家族，結構和分子功能上具有很多相似性，因此本研究的結果應該是準確可靠的.n = 6 ，平均值標準偏差圖 4 重金屬 CdCl 2 、PbAc 2 與 VDR 結合效應Fig. 4Dose- response curves of CdCl 2 or PbAc 2 for VDR一些研究發現，、氨 基、重金屬可以與含羥基巰基的酶結合，8Nesatyy從而抑制許多酶的活性.等18雌激素受體的結合研究也得到類

32、對重金屬與似與酶結合的結果，發現重金屬與受體蛋白的結合本質是依靠重金屬與氨基酸側鏈的受體蛋白分子表面的羥基、氨基、巰基結合，其中最主要依靠存在于受體分子蛋白表面的含半胱氨酸的螺旋，而結合活力的大小主要取決于半胱氨酸的硫基與重金屬的結合 . 通過對 hVDR基因 （NCBI LOCUS：AY342401 ）編碼氨基酸序列的分析，筆者發現hVDR 含有 大量具有羥基 、氨基和巰基側鏈氨基酸，其中側鏈含羥基氨基酸有 53 個 （絲氨酸 45 個 ，酪氨酸 8 個），側鏈含氨基 氨基酸有 82 個（天冬酰胺 13 個，谷氨酰胺 16 個，精氨酸 29 個，賴氨酸 24 個），含巰基氨基酸有17 個（半

33、胱氨酸 17 個），占總氨基酸個數的35. 8% . 這說明重 金 屬與 hVDR 分子 的結 合可 能和重金屬與雌激素受體的結合方式相同，也是通過結合分子表面氨基酸側鏈，引起的分子構象變化，從而可以與 TIF2 結合 . 將 CdCl 2 和 PbAc 2的影響進行比10 期焦健等 ：hVDR 原核表達及其與重金屬鎘、鉛的結合活性24 73較，在 相 同 的 濃 度 下，CdCl 2 與 hVDR 的 結 合 要 比 PbAc 2 與 hVDR 的 結 合 活性 弱 （圖 4 ），這 種結 合 活力的差異可能與Cd、Pb 與受體的結合構象有關. 從重金屬配位化學的角度Cd、Pb 與 蛋白結合

34、時的構象是 不 同的 ，Pb 離 子在與 半胱 氨酸 的 配 位基 -烷 基硫結合時傾向于形成三角椎體結構，Cd 離子在結合，19 時則傾向于形成四面體結構.而后者更為穩定目前重金屬導致佝僂病、骨質疏松癥等疾病已經被大量流行病學調查和動物實驗證實15. 對 其可能原因有2種主要解釋：第一種 是以前被普遍接，在腎外皮 細 胞堆積導致腎損受的觀點認為重金屬傷，降 低 了 1 羥 化 酶 活 性 的 活 性，從 而 使 得 25-OHD3 向1，25- （OH ）2 D3轉化受阻，血漿中 1，25-（OH ）2D3濃度過低 ，進而降低了腎小管對鈣磷重吸，2，6 ，收導致鈣磷吸收失衡 從而導致病癥的發

35、生但這種說法最近被 Engstrom7 等的 研究 結果 否定，他們發現重金屬導致骨骼疾病的發生與血漿中的23 水平無關，在重金屬暴露后血漿中1，25- （OH ） D的 1，25-（OH）2D3 濃度基本沒有變化，提出可能存在其他的機制 . 第二種原因是基于細胞水平的，發現重金屬直接提高了破骨細胞的活性 ，引起骨基質吸收異常增高，病的發生20 22，從而導致骨骼疾但 是這種說法目前還沒有信號通道機制的研究證據支持 . 本研究正好填補這一空白.因為以前有研究表明，VDR 的天然配體1 ，25- （OH ）2 D3 具有促 進破 骨參考文獻： 1 Bhattacharyya M H. Cadmi

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41、病骨質疏松癥等骨骼代謝異常疾病的機制更加系統和完整 .3 結論（1）建立了 VDR- LBD 的原核 表達方法和研究 hVDR 結合 活 性 物 質 擾 亂 hVDR 受 體 通 道 的 體 外方法 .（2） 發 現 鎘 （CdCl 2 ）和 鉛 （PbAc 2 ）均 在 100 mol / L 及 更 高 濃 度 水 平 時 能 顯 著 提 高 hVDR 與 TIF2-BAP 的非配體依賴性結合，從而影響正常的 hVDR 調控功能 ；認為鎘 、鉛可 以與 hVDR 結合，導致 hVDR 與核受體轉錄共激活因子結合，獲得轉 錄活性 ，引起破骨細胞數量和活性增加，最終造成骨質疏松等骨骼代謝異常的

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