1、原核表達(dá)載體的重要調(diào)控元件啟動(dòng)子啟動(dòng)子是 DNA 鏈上一段能與 RNA 聚合酶結(jié)合并起始 RNA 合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌 RNA 聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核音酸序列組成，對 mRNA 的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 510bp 處，有一段由 68 個(gè)堿基組成，富含 A 和 T 的區(qū)域，稱為 Pribnow 盒，又名 TATA 盒或10 區(qū)。來源不同的啟動(dòng)子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 35bp 處，有一段由

2、10bp 組成的區(qū)域，稱為-35 區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌 RNA 聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子。-35 區(qū)與 RNA 聚合酶 s 亞基結(jié)合，-10區(qū)與 RNA 聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近 DNA 被解旋形成單鏈，RNA 聚合酶使第一和第二核昔酸形成磷酸二酯鍵，以后在 RNA 聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的 RNA 鏈。原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有 Lac（乳糖啟動(dòng)子卜 Trp（色氨酸啟動(dòng)子卜 Tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子）、IPL（l 噬菌體的左向啟動(dòng)子）、T7 噬菌體啟動(dòng)子等。（1）Lac 啟動(dòng)子：它來自大腸桿菌的乳糖操縱子，是 DNA 分子上一段有方向的核音酸序列，由阻

3、遏蛋白基因（LacI）、啟動(dòng)基因（P）、操縱基因（O）和編碼 3 個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的基因結(jié)構(gòu)所組成。Lac 啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控。正調(diào)控通過 CAP（catabolitegeneactivationprotein）因子和 cAMP來激活啟動(dòng)子，促使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。負(fù)調(diào)控則是由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生 LacZ 阻遏蛋白，該阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄。乳糖及某些類似物如 IPTG 可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使其構(gòu)型改變，不能與。基因結(jié)合，從而解除這種阻遏，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄發(fā)生。（2）trp 啟動(dòng)子：它來自大腸桿菌的色氨酸操縱子，其阻遏蛋白必須與色氨酸結(jié)合才有活性。當(dāng)缺乏色氨酸時(shí)，該啟動(dòng)子開

4、始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)色氨酸較豐富時(shí)，則停止轉(zhuǎn)錄。b-口引噪丙烯酸可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，解除阻遏蛋白的活性，促使 trp 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。（3） Tac 啟動(dòng)子：Tac 啟動(dòng)子是一組由 Lac 和 trp 啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，受 Lac 阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié),它的啟動(dòng)能力比 Lac和 trp都強(qiáng)。 其中 Tac1是由 Trp啟動(dòng)子的一 35區(qū)加上一個(gè)合成的 46bpDNA片段 （包括 Pribnow盒）和 Lac 操縱基因構(gòu)成，Tac12 是由 Trp 的啟動(dòng)子-35 區(qū)和 Lac 啟動(dòng)子的-10 區(qū)，加上 Lac操縱子中的操縱基因部分和 SD 序列融合而成。Tac 啟動(dòng)子受 IPTG 的誘

5、導(dǎo)（4）1PL啟動(dòng)子：它來自 l 噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，是一種活性比 Trp 啟動(dòng)子高 11 倍左右的強(qiáng)啟動(dòng)子。IPL啟動(dòng)子受控于溫度敏感的阻遏物 cIts857。在低溫(30C)時(shí)，cIts857 阻遏蛋白可阻遏 PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(45C)時(shí)，cIts857 蛋白失活，阻遏解除，促使 PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。系統(tǒng)由于受 cIts857 作用，尤其適合于表達(dá)對大腸桿菌有毒的基因產(chǎn)物，缺點(diǎn)是溫度轉(zhuǎn)換不僅可誘導(dǎo) PL啟動(dòng)子，也可誘導(dǎo)熱休克基因，其中有一些熱休克基因編碼蛋白酶。如果用 1 噬菌體 cI+溶源菌，并用絲裂霉素 C 或紊咤酮酸進(jìn)行誘導(dǎo)，可緩解這一矛盾。（5）T7 噬菌體啟動(dòng)子：它是來自

6、 T7 噬菌體的啟動(dòng)子，具有高度的特異性，只有 T7RNA 聚合酶才能使其啟動(dòng)，故可以使克隆化基因獨(dú)自彳 I 到表達(dá)。T7RNA 聚合酶的效率比大腸桿菌 RNA 聚合酶高 5 倍左右，它能使質(zhì)粒沿模板連續(xù)轉(zhuǎn)錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。這個(gè)系統(tǒng)可以高效表達(dá)其他系統(tǒng)不能有效表達(dá)的基因。但要注意用這種啟動(dòng)子時(shí)宿主中必須含有 T7RNA 聚合酶。應(yīng)用 T7 噬菌體表達(dá)系統(tǒng)需要 2 個(gè)條件：第一是具有 T7 噬菌體 RNA 聚合酶，它可以由感染的 l 噬菌體或由插入大腸桿菌染色體上的一個(gè)基因拷貝產(chǎn)生；第二是在一個(gè)待表達(dá)基因上

7、游帶有 T7噬菌體啟動(dòng)子的載體。2 .SD 序列1974 年 Shine 和 Dalgarno 首先發(fā)現(xiàn)，在 mRNA 上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子 AUG 和一段位于 AUG 上游 310bp 處的由 39bp 組成的序列。這段序列富含嗯吟核昔酸，剛好與 16SrRNA3。末端的富含嗑咤的序列互補(bǔ)，是核糖體 RNA 的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為 Shine-Dalgarno 序列，簡稱SD 序列。它與起始密碼子 AUG 之間的距離是影響 mRNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與 SD 序列結(jié)合也會(huì)影響 mRNA 與核糖體的結(jié)合， 從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。 另外， 真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在 ATG 之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。3 .終止子在一個(gè)基因的 3 銖端或是一個(gè)操縱子的 3 銖端往往有特定的核音酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA 聚合酶停在 DNA 模板上不再前進(jìn)，RNA 的延伸也停止在終止信號(hào)上，完成轉(zhuǎn)錄的 RNA 從 RNA 聚合酶上釋放出來。對 RNA 聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含 A/T 的區(qū)域和一段富含 G/C 的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的 RNA