1、成員：成員： 1.肝微粒體溫孵液中對乙酰氨肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定方法的建立。基酚濃度測定方法的建立。2.熟練操作熟練操作HPLC。3.了解肝微粒體。了解肝微粒體。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容n1.建立非那西丁體外溫孵實驗測定其代謝速率的實驗方案。n2.開發(fā)大鼠肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚測定的方法，制備對乙酰氨基酚的標準曲線，并采用HPLC法建立標準曲線用于肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定。肝微粒體簡介肝微粒體簡介n肝細胞內(nèi)還含有肝微粒體，是藥物代謝及生物轉化的重要場所。肝微粒體實質(zhì)上由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片和核糖核酸顆粒組成。內(nèi)含多種與過氧化氫有關的酶系，又稱過氧小體，內(nèi)含膽固醇合成酶系，類固醇，

2、膽紅素和藥物結合酶系，以及與藥物代謝有關的酶系，可使脂溶性藥物代謝可使脂溶性藥物代謝成水溶性藥物，經(jīng)腎臟排泄。成水溶性藥物，經(jīng)腎臟排泄。肝微粒體受到損害時，藥物代謝發(fā)生障礙，藥物作用時間延長。n制備肝微粒體的方法有超速離心法、鈣沉淀法鈣沉淀法、聚乙二醇法等。 實驗過程實驗過程一、肝微粒體溫孵液的制備。一、肝微粒體溫孵液的制備。 肝微粒體的制備方法:1.取大鼠禁食24h,斷頭處死放盡血液，迅速剖開腹腔取出肝臟，剪碎肝組織，用預冷的Tris緩沖液洗凈血污，再用濾紙吸干表面水分后稱重，按1:3加入PBS后，加水至1000ml，冰浴，用玻璃勻漿器制成肝勻漿，于4C，12500r離心20min，取上清液

3、，與88mmol/LCaCl2 混勻，4C27000離心20min，取沉淀，再用0.1mmol/LTris緩沖液沖洗，4C27000離心緩沖20min，取沉淀。實驗過程實驗過程2.重懸沉淀重懸沉淀 將沉淀物懸浮于含20%甘油的磷酸鉀緩沖液中（1g組織加入1ml含20%甘油的磷酸鉀緩沖液），反復在冰水浴中吹打均勻，凍存管分裝后置-80冰箱內(nèi)保存待用。 3.蛋白定量蛋白定量 采用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。二、溫孵實驗。二、溫孵實驗。肝微粒體（0.2mg/mL,80L），非那西丁溶液（5，7. 5，10，15，20，25，30，40，60，80，100mol/L ）,100 mmol/L 磷酸鉀

4、緩沖（pH7.4）37水浴預溫孵5min。加入NADPH體系溶液（10 mmol/L 葡糖 6 磷酸、1 Um/L 葡糖 6 磷酸脫氫酶，4mmol/L氯化鎂，啟動劑，40L），在37水浴溫孵30min后， 加入冰甲醇（終止試劑，100L），終止溫孵。實驗過程實驗過程實驗過程實驗過程（為了考察大鼠微粒體反應中合適的終止試劑，對冰甲醇和冰乙腈的終止效果進行比較分析。發(fā)現(xiàn)選用冰乙腈作為終止試劑時，對乙酰氨基酚出峰位置存在干擾，而選用冰甲醇時，無內(nèi)源性干擾，因此選用冰甲醇作為終止試劑。）4下12000r/min離心15min，取上清液40L進行HPLC分析。 實驗過程實驗過程三、三、HPLC測定肝微

5、粒體溫孵液中對乙酰測定肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度。氨基酚濃度。色譜條件：Shimadzu Shim Pack VP ODS 柱( 150 mm 4. 6 mm，5 m)流速：1.0mL/min柱溫：室溫檢測波長：245nm采用梯度洗脫：流動相A為100mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH4.3），B為乙腈。 0 12 min，A B( 90 10) ， 12 17 min，A B( 75 25) ， 17 29 min，A B( 75 25) ，29 35 min，A B( 90 10) ， 35 40 min，A B( 90 10) HPLC 四、建立標準曲線與測定非那西丁體外溫四、建立標準曲線與測定非那西丁體外溫孵液代謝速率。孵液代謝速率。建立對乙酰氨基酚建立對乙酰氨基酚標準曲線標準曲線n取對乙酰氨基酚儲備液，已含有失活微粒體的甲醇水溶液( 1 1) 稀釋成0. 2，1，2，5，10，20 mol/L 的系列標準微粒體樣品，分別加入等體積的內(nèi)標( 10 mol/L間乙酰氨基酚) ，取20 L 按照色譜條件進行HPLC 分析，測定對乙酰氨基酚含量。n以對乙酰氨基酚與內(nèi)標峰面積比值( Y) 為縱坐標，對乙酰氨基酚濃度( X，mol/L ) 為橫坐標，繪制標準曲線。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理n記錄HPLC中對乙酰氨基酚和間乙酰氨基酚的峰面積，通過標準曲線計算出產(chǎn)