1、附件5藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則一、概述非臨床藥代動力學研究是通過體外和動物體內的研究方法，揭示藥物在體內的動態變化規律，獲得藥物的基本藥代動力學參數，闡明藥物的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 簡稱ADME）的過程和特征。非臨床藥代動力學研究在新藥研究開發的評價過程中起著重要作用。在藥物制劑學研究中，非臨床藥代動力學研究結果是評價藥物制劑特性和質量的重要依據。在藥效學和毒理學評價中，藥代動力學特征可進一步深入闡明藥物作用機制，同時也是藥效和毒理研究動物選擇的依據之一；藥物或活性代謝產物濃度數據及

2、其相關藥代動力學參數是產生、決定或闡明藥效或毒性大小的基礎，可提供藥物對靶器官效應（藥效或毒性）的依據。在臨床試驗中，非臨床藥代動力學研究結果能為設計和優化臨床試驗給藥方案提供有關參考信息。 本指導原則是供中藥、天然藥物和化學藥物新藥的非臨床藥代動力學研究的參考。研究者可根據不同藥物的特點，參考本指導原則，科學合理地進行試驗設計，并對試驗結果進行綜合評價。本指導原則的主要內容包括進行藥物非臨床藥代動力學研究的基本原則、試驗設計的總體要求、生物樣品的測定方法、研究項目（血藥濃度-時間曲線、吸收、分布、排泄、血漿蛋白結合、生物轉化、對藥物代謝酶活性及轉運體的影響）、數據處理與分析、結果與評價等，并

3、對研究中其他一些需要關注的問題進行了分析。附錄中描述了生物樣品分析和放射性同位素標記技術的相關方法和要求，供研究者參考。二、基本原則進行非臨床藥代動力學研究，要遵循以下基本原則：（一）試驗目的明確；（二）試驗設計合理；（三）分析方法可靠；（四）所得參數全面，滿足評價要求；（五）對試驗結果進行綜合分析與評價；（六）具體問題具體分析。三、試驗設計（一）總體要求1. 受試物中藥、天然藥物：受試物應采用能充分代表臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。應采用工藝路線及關鍵工藝參數確定后的工藝制備，一般應為中試或中試以上規模的樣品，否則應有充分的理由。應注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規

4、格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。由于中藥的特殊性，建議現用現配，否則應提供數據支持配制后受試物的質量穩定性及均勻性。當給藥時間較長時，應考察配制后體積是否存在隨放置時間延長而膨脹造成終濃度不準的因素。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規格及生產單位。化學藥物：受試物應采用工藝相對穩定、純度和雜質含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、

5、有效期、規格和生產單位等，并符合試驗要求。在藥物研發的過程中，若受試物的工藝發生可能影響其安全性的變化，應進行相應的安全性研究。化學藥物試驗過程中應進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應進行受試物樣品分析。2. 試驗動物 一般采用成年和健康的動物。常用動物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、小型豬和猴等。動物選擇的一般原則如下:2.1 首選動物：在考慮與人體藥代動力學性質相關性的前提下，盡可能選擇與毒理學和藥效學研究相同的動物。2.2 盡量在動物清醒狀態下進行試驗，最好從同一動物多次采樣獲取藥代動力學參數。2.3 創新性藥物應選用兩種或兩種以上的動物，其中一種為嚙齒類

6、動物；另一種為非嚙齒類動物（如犬、小型豬或猴等）。其他藥物，可選用一種動物，建議首選非嚙齒類動物。在動物選擇上，建議采用體外模型比較動物與人代謝的種屬差異性，包括代謝反應類型的差異和代謝產物種類及量的差異。通過比較，選取與人代謝性質相近的動物進行非臨床藥代評價；同時盡可能明確藥物代謝的研究對象（如：原形藥物、原形藥物與代謝產物、或幾個代謝產物同時作為藥代動力學研究觀察的對象）。2.4 經口給藥不宜選用兔等食草類動物。3. 劑量選擇動物體內藥代動力學研究應設置至少三個劑量組，低劑量與動物最低有效劑量基本一致，中、高劑量按一定比例增加。不同物種之間可根據體表面積或藥物暴露量進行劑量換算。主要考察在

7、所設劑量范圍內，藥物的體內動力學過程是屬于線性還是非線性，以利于解釋藥效學和毒理學研究中的發現，并為新藥的進一步開發和研究提供信息。4. 給藥途徑所用的給藥途徑和方式，應盡可能與臨床用藥一致，也要兼顧藥效學研究和毒理研究的給藥途徑。（二）生物樣品的分析方法生物樣品中藥物及代謝產物的分析方法包括色譜法、放射性同位素標記法和微生物學方法等。應根據受試物的性質，選擇特異性好、靈敏度高的測定方法。色譜法包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和色譜-質譜聯用法（如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS方法）。在需要同時測定生物樣品中多種化合物的情況下，LC-MS/MS和G

8、C-MS/MS聯用法在特異性、靈敏度和分析速度方面有更多的優勢。對于前體藥物或有活性（藥效學或毒理學活性）代謝產物的藥物，以及主要通過代謝從體內消除的藥物，建立生物樣品分析方法時應考慮測定原形藥和主要代謝產物，考察物質平衡（Mass Balance），闡明藥物在體內的轉歸。在這方面，放射性同位素標記法和色譜-質譜聯用法具有明顯優點。應用放射性同位素標記法測定生物樣品可配合色譜法，以保證良好的檢測特異性。如某些藥物難以用上述的檢測方法，可選用其他方法，但要保證其可靠性。方法學驗證（Validation）是生物樣品分析的基礎。所有藥代動力學研究結果，都依賴于生物樣品分析，只有可靠的方法才能得出可靠

9、的結果。應通過準確度、精密度、特異性、靈敏度、重現性、穩定性等研究，對建立的方法進行驗證。制備隨行標準曲線并對質控樣品進行測定，以確保生物樣品分析數據的可靠性。本指導原則提供了生物樣品分析方法的基本要求見附錄（一），研究時可根據藥物特點及分析方法的具體類型進行選擇。（三）研究項目1. 血藥濃度-時間曲線1.1 受試動物數：以血藥濃度-時間曲線的每個采樣點一般不少于5個數據為限計算所需動物數。建議受試動物采用雌雄各半。對于單一性別用藥，可選擇與臨床用藥一致的性別。1.2 采樣點：采樣點的確定對藥代動力學研究結果有重大影響，若采樣點過少或選擇不當，得到的血藥濃度-時間曲線可能與藥物在體內的真實情況

10、產生較大差異。給藥前需要采血作為空白樣品。為獲得給藥后一個完整的血藥濃度-時間曲線，采樣時間點的設計應兼顧藥物的吸收相、平衡相（峰濃度附近）和消除相。對于吸收快的血管外給藥藥物，應盡量避免第一個點是峰濃度（Cmax）；在Cmax附近需要3個時間點，盡可能保證Cmax的真實性。整個采樣時間應持續到35個半衰期，或持續到血藥濃度為Cmax的1/101/20。為保證最佳采樣點，建議在正式試驗前進行預試驗，然后根據預試驗的結果，審核并修正原設計的采樣點。同時應注意采血途徑和整個試驗周期的采血總量不影響動物的正常生理功能和血液動力學，一般不超過動物總血量的1520%。例如，每只大鼠24 h內采

11、血總量不宜超過2 mL。在采血方式上，同時也要兼顧動物福利（Animal welfare）。1.3 口服給藥：一般在給藥前應禁食12小時以上，以排除食物對藥物吸收的影響。另外在試驗中應注意根據具體情況統一給藥后禁食時間，以避免由此帶來的數據波動及食物的影響。1.4 多次（重復）給藥對于臨床需長期給藥或有蓄積傾向的藥物，應考慮進行多次（重復）給藥的藥代動力學研究。多次給藥試驗時, 一般可選用一個劑量(有效劑量)。 根據單次給藥藥代動力學試驗結果求得的消除半衰期，并參考藥效學數據, 確定藥物劑量、給藥間隔和連續給藥的天（次）數。1.5 血藥濃度測定按照已驗證的分析方法，對采集的生物樣品進行處理及分

12、析測定，獲得各個受試動物的各采樣點的血藥濃度數據。生物樣品的處理應與分析方法驗證中的處理方法一致。1.6 藥代動力學參數根據試驗中測得的各受試動物的血藥濃度-時間數據，求得受試物的主要藥代動力學參數。靜脈注射給藥，應提供消除半衰期（t1/2）、表觀分布容積（Vd）、血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）、清除率（CL）等參數值；血管外給藥，除提供上述參數外，還應提供峰濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）等參數，以反映藥物吸收、消除的規律。另外，應提供統計矩參數，如: 平均滯留時間（MRT）、AUC(0-t)和AUC(0-)等，對于描述藥物藥代動力學特征也是有意義的。1.7 應提供的數據 單次給藥

13、各個受試動物的血藥濃度-時間數據及曲線和各組平均值、標準差及曲線。各個受試動物的主要藥代動力學參數及各組平均值、標準差。對受試物單次給藥非臨床藥代動力學的規律和特點進行討論和評價。 多次（重復）給藥各個受試動物首次給藥后的血藥濃度-時間數據及曲線和主要藥代動力學參數及各組平均值、標準差和曲線。各個受試動物的3次穩態谷濃度數據及各組平均值、標準差。各個受試動物血藥濃度達穩態后末次給藥的血藥濃度-時間數據和曲線和主要藥代動力學參數，及各組平均值、標準差和曲線。比較首次與末次給藥的血藥濃度-時間曲線和有關參數。對受試物多次給藥非臨床藥代動力學的規律和特點進行討論和評價。2. 吸收對于經口給藥的新藥，

14、進行整體動物試驗時應盡可能同時進行血管內給藥的試驗，提供絕對生物利用度。如有必要，可進行體外細胞試驗、在體或離體腸道吸收試驗等以闡述藥物的吸收特性。對于其他血管外給藥的藥物及某些改變劑型的藥物，應根據立題目的，提供絕對生物利用度或相對生物利用度。建議采用非嚙齒類動物（如：犬或猴等）自身交叉試驗設計，用同一受試動物比較生物利用度。3. 分布一般選用大鼠或小鼠進行組織分布試驗，但必要時也可在非嚙齒類動物（如犬）中進行。通常選擇一個劑量（一般以有效劑量為宜）給藥后，至少測定藥物及主要代謝產物在心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、生殖腺、腦、體脂、骨骼肌等組織的濃度，以了解藥物在體內的主要分布組織和器官。特別

15、注意藥物濃度高、蓄積時間長的組織和器官，以及在藥效靶組織或毒性靶組織的分布（如對造血系統有影響的藥物，應考察在骨髓的分布）。必要時建立和說明血藥濃度與靶組織藥物濃度的關系。參考血藥濃度-時間曲線的變化趨勢，選擇至少3個時間點分別代表吸收相、平衡相和消除相的藥物分布。若某組織的藥物或代謝產物濃度較高，應增加觀測點，進一步研究該組織中藥物消除的情況。每個時間點，一般應有6個動物（雌雄各半）的數據。以下情況可考慮進行多次給藥后特定組織的藥物濃度研究：（1）藥物/代謝產物在組織中的半衰期明顯超過其血漿消除半衰期，并超過毒性研究給藥間隔的兩倍；（2）在短期毒性研究、單次給藥的組織分布研究或其他藥理學研究

16、中觀察到未預料的，而且對安全性評價有重要意義的組織病理學改變；（3）定位靶向釋放的藥物。進行組織分布試驗，必須注意取樣的代表性和一致性。4. 排泄建議同時提供嚙齒類和非嚙齒類動物的排泄數據，嚙齒類（大鼠、小鼠等）每個性別3只動物，非嚙齒類（如犬）每個性別23只動物。根據藥物特性，也可選擇單一性別動物，但需說明。4.1 尿和糞的藥物排泄：將動物放入代謝籠內，選定一個有效劑量給藥后，按一定的時間間隔分段收集尿或糞的全部樣品，直至收集到的樣品中藥物和主要代謝產物低于定量下限或小于給藥量的1%。糞樣品收集后按一定比例制成勻漿，記錄總重量或體積，取部分尿或糞樣品進行藥物和主要代謝產物濃度測定或代謝產物譜

17、（Metabolite profile）分析，計算藥物和主要代謝產物經此途徑排泄的速率及排泄量。每個時間段至少有5只動物的試驗數據。4.2 膽汁排泄：一般在動物麻醉下作膽管插管引流，待動物清醒且手術完全恢復后給藥，并以合適的時間間隔分段收集膽汁，進行藥物和主要代謝產物測定。4.3 記錄藥物及主要代謝產物自糞、尿、膽汁排出的速度及總排出量（占總給藥量的百分比），提供物質平衡的數據。5. 與血漿蛋白的結合一般情況下，只有游離型藥物才能通過脂膜向組織擴散，被腎小管濾過或被肝臟代謝，因此藥物與蛋白的結合會明顯影響藥物分布與消除的動力學過程，并降低藥物在靶部位的濃度。建議根據藥理毒理研究所采用的動物種屬

18、，進行動物與人血漿蛋白結合率比較試驗，以預測和解釋動物與人在藥效和毒性反應方面的相關性。研究藥物與血漿蛋白結合可采用多種方法，如平衡透析法、超過濾法、分配平衡法、凝膠過濾法、色譜法等。根據藥物的理化性質及試驗室條件，可選擇使用一種方法進行至少3個濃度（包括有效濃度）的血漿蛋白結合試驗，每個濃度至少重復試驗次，以了解藥物與血漿蛋白結合率以及可能存在的濃度依賴性和血漿蛋白結合率的種屬差異。對血漿蛋白結合率高，且安全范圍窄的藥物，建議開展體外藥物競爭結合試驗，即選擇臨床上有可能合并使用的高蛋白結合率藥物，考察對所研究藥物蛋白結合率的影響。6. 生物轉化對于創新性的藥物，尚需了解在體內的生物轉化情況，

19、包括轉化類型、主要轉化途徑及其可能涉及的代謝酶表型。對于新的前體藥物, 除對其代謝途徑和主要活性代謝產物結構進行研究外, 尚應對原形藥和活性代謝產物進行系統的藥代動力學研究。而對主要在體內以代謝消除為主的藥物(原形藥排泄<50%)，生物轉化研究則可分階段進行：臨床前可先采用色譜方法或放射性同位素標記方法分析和分離可能存在的代謝產物，并用色譜-質譜聯用等方法初步推測其結構。如果臨床研究提示其在有效性和安全性方面有開發前景，需進一步研究并闡明主要代謝產物的代謝途徑、結構及酶催化機制。但當多種跡象提示可能存在有較強活性或毒性的代謝產物時，應盡早開展活性或毒性代謝產物的研究，以確定開展代謝產物動

20、力學試驗的必要性。體內藥物生物轉化可考慮與血藥濃度-時間曲線和排泄試驗同時進行，應用這些試驗采集的樣品進行代謝產物的鑒定及濃度測定。應盡早考察藥效和毒性試驗所用的實驗動物與人體代謝的差異。這種差異有兩種情況，其一是量的差異，動物與人的代謝產物是一致的，但各代謝產物的量不同或所占的比例不同；其二是質的差異，即動物與人的代謝產物是不一致的，這時應考慮這種代謝的種屬差異是否會影響到其藥效和毒性，并以此作為藥效和毒性試驗動物選擇的依據。建議在早期非臨床藥代動力學研究時，進行藥物體外（如動物和人肝組織勻漿、原代肝細胞、肝S9、肝微粒體等）代謝試驗，以預測動物與人體體內代謝有無差異。7. 藥物代謝酶及轉運

21、體研究藥物的有效性及毒性與血藥濃度或靶器官濃度密切相關。一定劑量下的血藥濃度或靶器官濃度取決于該藥物的吸收、分布、代謝及排泄過程（ADME），而代謝酶和轉運體是影響藥物體內過程的兩大生物體系，是藥物ADME的核心機制之一。因此，創新性藥物的研究開發應該重點關注藥物吸收和主要消除途徑的確定、代謝酶和轉運體對藥物處置相對貢獻的描述、基于代謝酶或轉運體的藥物-藥物相互作用的評估等。體外試驗體系是評價藥物代謝酶和轉運體作用機制的有力手段，應結合體內試驗，綜合評價藥物的處置過程。非臨床ADME研究應主要采用人源化材料（如：人肝微粒體、肝S9、原代肝細胞及P450重組酶等），鑒定藥物是否是代謝酶的底物或抑

22、制劑。P450同工酶之外的藥物代謝酶，如葡萄糖醛酸結合酶、硫酸轉移酶等，也應該在適當的情況下進行評估。對細胞色素P450同工酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等）抑制的考察可以通過使用類藥性探針底物（Drug-like Probe Substrate）完成。抑制試驗應該在酶動力學線性范圍進行，即探針底物藥物的濃度£Km（米氏常數），抑制強弱通過IC50或Ki判斷。P450同工酶抑制試驗的思路與方法適用于其他藥物代謝酶和轉運體的研究評價。藥物對P450酶的誘導應該重點對人CYP3A4以及CYP1A2、CYP2B6進行評

23、估。體外誘導試驗可運用人肝細胞多次給藥后相關mRNA表達和/或酶活性的變化進行評價。具有重要臨床意義的外排和攝入轉運體主要包括P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3和OCT2等，建議針對這些轉運體進行研究。除此之外的其他轉運體研究，在必要時也可予以考慮。創新藥物非臨床ADME研究還應該考慮到代謝酶與轉運體之間的相互影響及潛在的相互作用、人特異性代謝產物的評估等。8. 物質平衡在臨床前和臨床早期階段，特別是毒性劑量和有效治療劑量范圍確定的情況下運用放射性標記化合物，可通過收集動物和人體糞、尿以及膽汁以研究藥物的物質平衡。這些研究能夠獲得化合物的排泄途徑和排泄速率等

24、信息，而且有助于代謝產物的性質鑒定，并通過有限的數據比較它們的體內吸收和分布特點。通過體外和動物樣品中分離出的代謝產物有時可作為參比品用于臨床和非臨床的定量研究。同時，組織分布研究和動物膽管插管收集的膽汁能夠提供藥物的組織分布數據和明確膽汁清除特點。一般應采用放射性同位素標記技術研究物質平衡。有關試驗方法的介紹及相關考慮見附錄（二）。考慮到每一個化合物及其代謝產物具有各自的理化特性，在開展不同化合物的同位素標記研究時對試驗方法作慎重的調整/修改是很有必要的。四、數據處理與分析應有效整合各項試驗數據，選擇科學合理的數據處理及統計方法。如用計算機處理數據，應注明所用程序的名稱、版本和來源，并對其可

25、靠性進行確認。五、試驗結果與評價對所獲取的數據應進行科學和全面的分析與評價，綜合論述藥物在動物體內的藥代動力學特點，包括藥物吸收、分布和消除的特點；經尿、糞和膽汁的排泄情況；與血漿蛋白結合的情況；藥物在體內蓄積的程度及主要蓄積的器官或組織；如為創新性的藥物，還應闡明其在體內的生物轉化、消除過程及物質平衡情況。在評價的過程中注意進行綜合評價，分析藥代動力學特點與藥物的制劑選擇、有效性和安全性的關系，從體外試驗和動物體內試驗的結果，推測臨床藥代動力學可能出現的情況，為藥物的整體評價和臨床研究提供更多有價值的信息。六、附錄（一）生物樣品分析方法的基本要求1. 基本概念生物樣品分析方法的基本參數包括：

26、（1）準確度，（2）精密度，（3）特異性，（4）靈敏度，（5）重現性，（6）穩定性。現將相關的概念介紹如下：準確度：在確定的分析條件下，測得值與真實值的接近程度。精密度：在確定的分析條件下，相同基質中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。特異性：分析方法測量和區分共存組分中分析物的能力。這些共存組分可能包括代謝產物、雜質、分解產物、基質組分等。靈敏度：生物樣品分析方法的靈敏度主要通過測定定量下限樣品的準確度和精密度來表征。重現性：不同試驗室間測定結果的分散程度，以及相同條件下分析方法在間隔一段短時間后測定結果的分散程度。穩定性：一種分析物在確定條件下，一定時間內在給定基質中的化學穩定性。標準曲

27、線：試驗響應值與分析物濃度間的關系。應采用適當的加權和統計檢驗，用簡單的數學模型來最適當地描述。標準曲線應是連續的和可重現的，應以回歸計算結果的百分偏差最小為基礎。提取回收率：分析過程的提取效率，以樣品提取和處理過程前后分析物含量百分比表示。定量范圍：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的濃度范圍，在此范圍內采用濃度-響應關系能進行可靠的、可重復的定量，其準確度和精密度可以接受。生物基質：一種生物來源物質，能夠以可重復的方式采集和處理。例如全血、血漿、血清、尿、糞、各種組織等。基質效應：由于樣品中存在干擾物質，對響應造成的直接或間接的影響。分析批：包括待測樣品、適當數目的標準樣品和質

28、控樣品的完整系列。一天內可以完成幾個分析批，一個分析批也可以持續幾天完成。標準樣品：在生物基質中加入已知量分析物配制的樣品，用于建立標準曲線，計算質控樣品和未知樣品中分析物濃度。質控樣品：即QC樣品，系指在生物基質中加入已知量分析物配制的樣品，用于監測生物分析方法的重復性和評價每一分析批中未知樣品分析結果的完整性和正確性。2. 生物樣品分析方法的建立和驗證由于生物樣品取樣量少、藥物濃度低、內源性物質（如無機鹽、脂質、蛋白質、代謝產物）及個體差異等多種因素影響生物樣品測定，所以必須根據待測物的結構、生物基質和預期的濃度范圍，建立適宜的生物樣品分析方法，并對方法進行驗證。分析方法驗證分為全面驗證和

29、部分驗證兩種情況。對于首次建立的生物樣品分析方法、新的藥物或新增代謝產物定量分析，應進行全面方法驗證。在其他情況下可以考慮進行部分方法驗證，如生物樣品分析方法在試驗室間的轉移、定量濃度范圍改變、生物基質改變、稀少生物基質（動物組織樣品）、證實復方給藥后分析方法的特異性等。應考察方法的每一步驟，確定從樣品采集到分析測試的全過程中，環境、基質、材料或操作上的可能改變對測定結果的影響。（1）特異性必須證明所測定的物質是預期的分析物，內源性物質和其他代謝產物不得干擾樣品的測定。對于色譜法至少要考察6個不同個體空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品（注明樣品來源

30、基質、用藥后的時間）色譜圖。對于以軟電離質譜為基礎的檢測方法（LC-MS、LC-MS/MS等），應注意考察分析過程中的基質效應，如離子抑制等。（2）標準曲線與定量范圍根據所測定物質的濃度與響應的相關性，用回歸分析方法（如用加權最小二乘法）獲得標準曲線。標準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。用至少5個濃度建立標準曲線，應使用與待測樣品相同的生物基質，定量范圍要能覆蓋全部待測濃度，不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標準曲線時應隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點。（3）精密度與準確度要求選擇3個濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度考

31、察。低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的3倍或3倍以內；高濃度接近于標準曲線的上限；中間選一個濃度。每一濃度每批至少測定5個樣品，為獲得批間精密度，應至少3個分析批合格。精密度用質控樣品的批內和批間相對標準差（RSD）表示，相對標準差一般應小于15%，在定量下限附近相對標準差應小于20%。準確度一般應在85%115%范圍內，在定量下限附近應在80%120%范圍內。（4）定量下限定量下限是標準曲線上的最低濃度點，要求至少能滿足測定35個半衰期時樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/101/20時的藥物濃度，其準確度應在真實濃度的80%120%范圍內，RSD應小于20%。應由至少5個標準樣品測

32、試結果證明。（5）樣品穩定性根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進行穩定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意儲備液的穩定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩定性。（6）提取回收率應考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結果應精密和可重現。（7） 稀釋可靠性 樣品稀釋不應影響準確度和精密度。應該通過向基質中加入分析物至高于標準曲線上限濃度，并用空白基質稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5 個測定值），來證明稀釋的可靠性。準確度和精密度應在±15%之內。稀釋的可靠性應該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數。（8） 殘留方法開發期間應使殘留最小化。方法驗證期間應通

33、過檢測標準曲線定量上限濃度后測定空白樣品來確定其殘留，通常殘留應不大于定量下限的20%。生物樣品分析期間也應進行殘留檢測，如在測定高濃度樣品后和分析下一個樣品之前測定空白樣品。（9） 微生物學分析上述分析方法驗證的很多參數和原則也適用于微生物學分析，但在方法驗證中應考慮到它們的一些特殊之處。結果的準確度是關鍵的因素，如果重復測定能夠改善準確度，則應在方法驗證和未知樣品測定中采用同樣的步驟。（10）組織分布樣品組織分布樣品由于每種組織樣本數目少，所以其分析方法只需驗證選擇性、日內精密度和準確度等。通常選擇一兩種代表性組織（如肝、肺、腎、大腸等）進行分析方法驗證。3.生物樣品分析方法的應用應在生物

34、樣品分析方法驗證完成之后開始測試未知樣品。推薦由獨立的人員配制不同濃度的標準樣品對分析方法進行考核。每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。藥代動力學比較試驗中，來自同一個體的生物樣品最好在同一分析批中測定。每個分析批應建立標準曲線，隨行測定高、中、低3個濃度的質控樣品，每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質控樣品數，使質控樣品數大于未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應小于15%，最多允許1/3質控樣品的結果超限，但不能在同一濃度中出現。如質控樣品測定結果不符合上述要求，則該分析批樣品測試結果作廢。同一天內進行不同

35、組織樣品測試時，用代表性組織作為基質建立標準曲線，但質控樣品應采用目標空白組織制備。根據當日標準曲線計算質控樣品的濃度，若相對偏差在±15%之內，則可共用一條標準曲線，否則采用與待測組織樣品相同的空白組織建立標準曲線。濃度高于定量上限的樣品，應采用相應的空白基質稀釋后重新測定。對于濃度低于定量下限的樣品，在進行藥代動力學分析時，在達到Cmax以前取樣的樣品應以零值計算，在達到Cmax以后取樣的樣品應以無法定量（Not detectable, ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。4.分析數據的記錄與保存分析方法的有效性應通過試驗證明。在分析報告中，應提供成功完成這些試驗工作的相關

36、資料。建立一般性和特殊性標準操作規程，保存完整的試驗記錄是分析方法有效性的基本要素。生物分析方法建立中產生的數據和QC樣品測試結果應全部記錄并妥善保存，必要時接受檢查。5.需提交的數據與材料提供給藥品注冊管理部門的材料應當包括：（1）綜合信息；（2）方法建立的數據；（3）在日常樣品分析中的基本資料；（4）其他相關信息。（1）綜合信息項目編號、分析方法編號、分析方法類型、分析方法驗證簡化的理由，以及相應的項目計劃編號、標題等。（2）方法建立的數據分析方法的詳細描述；該方法所用對照品（被測藥物、代謝產物、內標物）的純度和來源；穩定性試驗描述及相關數據；描述測定選擇性、準確度、精密度、回收率、定量限

37、、標準曲線的試驗并給出獲得的主要數據；列出批內、批間精密度和準確度的詳細結果。根據具體情況提供代表性的色譜圖或質譜圖并加以說明。此外，尚需對所建立的方法學在實際分析過程中的優缺點進行評價。（3）在日常樣品分析中的基本資料所用樣品（受試物、代謝產物、內標物）的純度和來源。樣品處理和保存的情況，樣品編號、采集日期、運輸前的保存、運輸情況、分析前的保存。信息應包括日期、時間、樣品所處條件，以及任何偏離試驗計劃的情況。樣品分析批的綜合信息，包括分析批編號、分析日期、分析方法、分析人員、開始和結束時間、主要設備和材料的變化，以及任何可能偏離分析方法建立時的情況。用于計算結果的回歸方程，分析樣品時標準曲線

38、列表，各分析批質控樣品測定結果綜合列表并計算批內和批間精密度、準確度，各分析批包括的未知樣品，濃度計算結果。在現場考核中，應能提供全部受試物樣品測試的色譜圖或其他原始數據，包括相應分析批的標準曲線和質控樣品的色譜圖或其他原始數據。注明缺失樣品的原因，重復測試的結果。應對舍棄任何分析數據和選擇所報告的數據說明理由。（4）其他相關信息縮略語列表、參考文獻列表、標準操作規程列表。（二）應用放射性同位素標記技術進行藥物非臨床藥代動力學研究新藥研發過程中，了解候選藥物在人體和用于毒理和藥效研究的動物體內的變化情況至關重要。因此，在新藥研發不同階段必須進行各種體內、體外藥代試驗以闡明候選藥物的吸收、分布、

39、代謝和排泄（ADME）等性質。尤其是對于僅在人體存在的代謝產物，或在穩態時體內暴露水平高于所有與藥物相關物質總暴露量的10%并遠高于任何毒理試驗動物種屬中的水平的代謝產物，會有藥物安全性隱患，需進行代謝產物安全性研究。盡管液質聯用技術已大量應用于這些試驗，但放射性同位素標記技術仍被廣泛使用。低能量放射性同位素（如14C、3H）標記化合物應用于藥代動力學研究，因其生物界背景值很低因而檢測容易且靈敏、半衰期較長而不需根據放射性半衰期校正試驗結果、可定量分析候選藥物產生的代謝產物而不需知道它們的結構、產生的非離子化-射線能量極低而不需特殊防護，被證明為一種安全有效的特殊技術，其結果簡單、明了、可靠，

40、目前在多數情況下尚無別的取代方法。1.放射性同位素標記藥代動力學研究的應用范圍低能量放射性同位素標記技術可用于多方面ADME試驗中，如: 1) 進行原形藥和代謝產物總體和分別的藥動學研究，確定總體的系統暴露和生物利用度等; 2) 考察物質平衡及排除途徑; 3) 確定血液和排泄物中的代謝產物譜，結合色譜與質譜技術可利于代謝產物鑒定; 4) 確定體內清除機制; 5) 進行肝細胞、肝微粒體等體外藥代動力學試驗可獲得全面的人和動物（如小鼠、大鼠、兔、犬、猴等）體外代謝產物譜、顯示種屬差異、幫助毒理研究動物種屬的選擇; 6) 鑒于同一種放射性同位素在不同結構的化合物（如：藥物或代謝產物）上產生相同的放射

41、能量，放射性代謝產物可用于同種動物穩態時、其他動物種屬及人體中產生的代謝產物的定性定量分析，有助于人體代謝酶的鑒定，早期發現人體高比例代謝產物，并為藥物相互作用研究的試驗設計提供依據; 7) 獲得組織分布數據。大鼠給藥后不同時間點的整體放射自顯影結果還可為臨床放射性劑量的計算提供數據。2.放射性同位素標記方法的選擇小分子化學藥物ADME研究中常用的低能量放射性同位素為碳-14（14C）和氚（3H）。14C標記最為常用，其生物界背景低，生物學幾乎無同位素效應而影響代謝，極少發生同位素交換，靈敏度較3H高而容易定量。標記碳-14化合物時應選擇代謝穩定的位點。體內試驗除非14C標記非常困難或根本無法

42、標記、給藥劑量極低需很高的比活性時才選用3H標記。3H標記相對簡單并比14C標記化合物比活性高，尤其適合小劑量給藥化合物或早期生物轉化研究；同樣，氚標記化合物時也應選擇代謝穩定的位點作為標記位點，不推薦非定位的氚水交換標記方式。 14C和3H標記化合物的放化純度與化學純度一般均應95%，并不含有>1%的單一雜質。3.放射性同位素標記藥物的藥代動力學試驗放射性化合物藥代動力學試驗與非標記藥物藥代動力學試驗相似，如劑量、給藥途徑、受試動物等等。劑量除按常規劑量水平(mg/kg)表示外，還需提供放射性劑量（µCi/kg）。給藥制劑的配制和給藥途徑一般也應與非標記藥代動力學試驗相似，特

43、殊情況需說明。為減少實驗誤差，常采用稱重法確定實際給藥量。樣品收集常包括全血、血漿、尿液、膽汁、糞便、籠具清洗液及組織等樣本。血液樣本的收集時間點可根據藥物的藥代動力學參數決定，排泄物一般采樣710天（對于長半衰期的藥物，應適當延長采樣時間），或采樣至排出的放射性量超過給藥量的90%或連續2天的排出放射性量小于放射性給藥劑量的1%。進行小動物（如小鼠、大鼠等）物質平衡試驗時，如總放射性回收率<90%，應測定尸體殘留總放射量，必要時應解剖動物，觀察藥物的主要儲留部位和組織。為防止原形藥及代謝產物降解，尿液和膽汁收集過程中容器置放于干冰內。樣品處理（如液體樣品離心去固體雜質、血漿、糞便及組織

44、提取等）和分析（如應用HPLC和在線或離線放射性檢測儀聯用獲得放射性代謝產物譜）應密切關注放射性的回收率，一般總回收率應85%。應根據放射性代謝產物譜研究獲得的各代謝產物的血漿暴露量百分比和在排泄物中占給藥百分率選擇需要鑒定的代謝產物，并使用HPLC在線或離線放射性檢測儀幫助鑒定工作中對代謝產物的監測。放射性ADME試驗報告除包括常規藥代動力學研究內容外，還應提供放射性同位素標記藥物的標記位置、放化純度、化學純度、比活度等以及在給藥制劑中的放化穩定性數據。實驗結果應提供放射性回收率，代謝產物鑒定需提供質譜和在線或離線放射性檢測儀關聯數據。（三）幾個需要關注的問題1.關于中藥、天然藥物藥代動力學

45、研究在中藥、天然藥物新藥研究開發的過程中，通過對活性成分或活性代謝產物非臨床藥代動力學研究，了解其相關藥代動力學參數，可作為闡明藥效或毒性產生的基礎及了解藥效或毒性反應靶器官的依據，并為設計和優化臨床試驗給藥方案提供有關參考信息。中藥活性成分情況較為復雜，有些活性成分較為單一，有些物質基礎比較清楚但成分較多，有些活性成分復雜且不清楚。對于活性成分單一的中藥、天然藥物，其非臨床藥代動力學研究與化學藥物基本一致。對于非單一活性成分但物質基礎基本清楚的中藥、天然藥物，其中藥效或毒性反應較強、含量較高的成分，一般需要進行藥代動力學探索性研究。對于活性成分復雜且物質基礎不太清楚的中藥、天然藥物，應根據對

46、其中部分已知成分文獻研究的基礎上，重點考慮是否進行有明確毒性成分的非臨床藥代動力學研究。若有足夠證據表明某類結構相似的一類成分中某一個成分的藥代動力學屬性可以代表該類成分的藥代動力學特征，可從同類成分中選擇一個代表性成分進行測定。被測成分應根據機體的暴露水平和暴露形式，以及藥效作用/安全性相關性等因素來確定。此外，在進行中藥、天然藥物非臨床藥代動力學研究時，應充分考慮中藥、天然藥物所含化學成分不同于化學合成藥物的特點，結合其特點選擇適宜的方法開展體內過程或活性代謝產物的研究，為后續研發提供參考。若擬進行的臨床試驗中涉及到與其他藥物（特別是化學藥）聯合應用，應考慮通過體外、體內試驗開展藥物相互作

47、用研究。2.關于藥代動力學研究的體外方法隨著體外生物技術的發展，為深層次地了解和闡明藥物的某一性質以及與藥效和毒性的相關性，不少藥代動力學的體外方法有效地應用于藥物代謝和相互作用評價，如體外吸收模型（Caco-2細胞模型）、體外肝系統研究、體外轉運系統等。這些體外方法學在推測人藥代動力學參數和特征時，提供了同種屬的體外到體內的推測。體外方法學可以通過應用不同輔酶、不同選擇性抑制物，不同重組基因純酶，在試驗設計上，可以彌補動物體內方法學的缺陷。人和動物的體外方法學結合動物的體內方法學，在新藥研發的臨床前階段，可以較準確和有效地評價藥物的吸收、運轉、分布、代謝，比如藥物代謝產物鑒定、代謝途徑鑒定、

48、藥物對代謝酶和轉運體的抑制和誘導等，為闡明藥理和毒理作用機制和設計第一個臨床研究劑量和評價潛在性藥物代謝性或運轉性相互作用提供可靠的參數。藥代動力學的體外方法學的應用，在不影響或優化臨床前研究信息量的同時，減少了實驗動物的使用，使動物倫理學的實施逐漸可行。對于體外研究發現有明顯種屬差異的藥物，應進一步分析解釋。3.關于動物選擇由于動物藥代動力學研究是聯系動物研究與人體研究的重要橋梁，動物選擇的恰當與否是該研究價值大小的關鍵。應盡量選擇適宜的動物來進行研究，如口服給藥的藥物不宜選擇食草類動物或與人胃腸道情況差異較大的動物，以免由于吸收的差異造成試驗結果不能充分提示臨床。對于創新性的藥物，可利用體

49、外藥代動力學手段預先對動物種屬進行篩選，以選擇藥物動力學特點與人體最接近的動物，提高試驗結果的臨床預測價值。由此也可為毒性試驗選擇合適的動物種屬提供依據，并對毒性試驗與人體的相關性做出判斷。4.關于手性藥物對映異構體具有幾乎相同的物理性質（旋光性除外）和化學性質（在手性環境中除外），通常需要特殊的手性技術對它們進行鑒定、表征、分離和測定，但生物系統常常很容易區分它們，并可能導致不同的藥代動力學性質（吸收、分布、代謝、排泄），以及藥理學、毒理學效應的量或質的區別。為評價單一對映體或對映體混合物的藥代動力學，研究者應在藥物開發前期，建立適用于體內樣品對映體選擇性分析的定量方法，為后期研究對映體之間

50、的相互轉化以及各自的吸收、分布、代謝和排泄提供方法學基礎。如果外消旋體已經上市，研究者希望開發單一對映體，則應測定該對映體轉化為另一對映體的程度是否顯著，以及該對映體單獨用藥是否與其作為外消旋體組分時的藥代動力學性質一致，這對豐富和解釋單一對映體研發的立題依據、優化劑量、制定給藥方案具有重要的意義。為監測對映異構體在體內的相互轉化和處置，應獲得單一對映體在動物體內的藥代動力學曲線，并與其后在臨床I期試驗中獲得的藥代動力學曲線相比較。附件6藥物毒代動力學研究技術指導原則一、 概述毒代動力學研究目的是獲知受試物在毒性試驗中不同劑量水平下的全身暴露程度和持續時間，預測受試物在人體暴露時的潛在風險（注

51、釋1）。毒代動力學是非臨床毒性試驗的重要研究內容之一，其研究重點是解釋毒性試驗結果和預測人體安全性，而不是簡單描述受試物的基本動力學參數特征。毒代動力學研究在安全性評價中的主要價值體現在：（一）闡述毒性試驗中受試物和/或其代謝物的全身暴露及其與毒性反應的劑量和時間關系；評價受試物和/或其代謝物在不同動物種屬、性別、年齡、機體狀態（如妊娠狀態）的毒性反應；評價非臨床毒性研究的動物種屬選擇和用藥方案的合理性。（二）提高動物毒性試驗結果對臨床安全性評價的預測價值。依據暴露量來評價受試物蓄積引起的靶部位毒性（如肝臟或腎臟毒性），有助于為后續安全性評價提供量化的安全性信息。（三）綜合藥效及其暴露量和毒性

52、及其暴露信息來指導人體試驗設計，如起始劑量、安全范圍評價等，并根據暴露程度來指導臨床安全監測。本指導原則適用于中藥、天然藥物和化學藥物。生物制品的毒代動力學研究可參考本指導原則（注釋2）。二、基本原則毒代動力學研究需執行藥物非臨床研究質量管理規范（GLP）（注釋3）。毒代動力學試驗通常伴隨毒性試驗進行，常被稱為伴隨毒代動力學試驗。開展研究時可在所有動物或有代表性的亞組或衛星組動物中進行，以獲得相應的毒代動力學數據（注釋4）。三、基本內容（一）暴露量評估毒代動力學試驗的基本目的是評估受試物和/或其代謝物的全身暴露量，常通過適當數量的動物和劑量組來開展研究。伴隨毒代動力學研究所用動物數量應保證能獲

53、得足夠的毒代動力學數據。由于毒性試驗中通常采用兩種性別動物，暴露測定也應包括兩種性別的動物。選擇單性別動物時應說明理由（注釋5）。暴露評估應考慮以下因素（注釋6）：血漿蛋白質結合、組織攝取、受體性質和代謝特征的種屬差異、代謝物的藥理活性、免疫原性和毒理學作用。在血漿藥物濃度相對較低時，特殊的組織或器官也可能會有較高水平的受試物和/或其代謝物。對于血漿蛋白結合率高的化合物，用游離（未結合）濃度來表示暴露更為合適。暴露評估中需關注血漿或體液中代謝物濃度的情況有：1）受試物為“前體化合物”且其轉化生成的代謝物為主要活性成分；2）受試物可被代謝為一種或多種具有藥理或毒理活性代謝物，且代謝物可導致明顯的

54、組織/器官反應；3）受試物在體內被廣泛代謝，毒性試驗僅可通過測定血漿或組織中的代謝物濃度來進行暴露評估。 （二）毒代動力學參數毒代動力學研究是通過測定合適時間點的樣品濃度來計算動力學參數的。暴露程度可用原型化合物和/或其代謝物的血漿（血清或全血）濃度或AUC來表示。某些情況下，可選擇測定組織中的受試物濃度（見注釋7）。用于評估的毒代動力學參數通常有： AUC0-T、Cmax、C(time)。某些試驗可考慮僅開展毒代動力學的監測或特征的研究（注釋8）。（三）給藥方案毒代動力學試驗的給藥方案設計應完全參照毒性試驗研究方案，包括給藥劑量、途徑、動物種屬選擇和給藥頻率、周期等。為達到毒性反應的最大暴露

55、，應評估高劑量水平下受試物和/或其代謝物的暴露程度（注釋9）。某些情況下，非臨床試驗中可能會采用與臨床擬用藥方式不同的給藥方式（如不同的給藥途徑、不同制劑）開展毒性試驗，此時應依據暴露量評估全身暴露是否充分。（四）樣品采集伴隨毒代動力學研究中，樣品采集的時間點應盡量達到暴露評價所需的頻度，但不可過于頻繁，避免干擾毒性試驗的正常進行并引起動物過度的生理應激反應。每項研究中的時間點數量應滿足暴露評價的要求，時間點的確定應以早期毒性試驗、預試驗或劑量探索毒性試驗以及在相同動物模型或可以合理外推的其它動物模型上獲得的動力學數據為基礎。應該考慮樣品是從所有的實驗動物采集，還是從具有一定代表性的亞組或衛星

56、組動物采集。通常情況下，在大動物的毒性試驗中毒代動力學數據從主研究實驗動物收集，而嚙齒類動物的毒性試驗中毒代動力學數據可從衛星組實驗動物收集。采集血樣的前提是受試物在血漿中的暴露量與作用靶點或毒性靶點的受試物濃度存在動態平衡關系，并且受試物容易進入動物和人的全身系統。若血液中受試物暴露量無法反映靶組織或器官的毒性反應時，則可能需要考慮采用尿液、其他體液、靶組織或器官來測定受試物濃度。（五）分析方法 毒代動力學研究的分析方法應基于早期建立的分析物和生物基質（生物體液或組織）的分析方法，且要根據代謝和種屬差異而定。分析方法應具有特異性，并且有足夠的精確度和精密度，檢測限應滿足毒代動力學研究時預期的

57、濃度范圍。分析物和生物基質分析方法的選擇應排除樣本中內源性物質可能引起的干擾。如果分析物是消旋體或對映異構體的混合物，應予以說明。生物樣品分析方法的具體技術要求可參考藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則中的相應內容。（六）數據統計與評價暴露評價的數據需有代表性。由于動力學參數多存在個體差異，且毒代動力學資料多來源于小樣本的動物，因此通常難以進行高精度的統計學處理。統計分析時應注意求算平均值或中位數并評估變異情況。某些情況下，個體動物的數據比經整理、統計分析過的成組數據更為重要。如果進行了數據轉換（如對數轉換），應提供理由。在評估連續給藥是否引起體內蓄積時，不僅要觀察是否出現蓄積現象，還要結合受

58、試物半衰期長短、受試物暴露對關鍵代謝酶或轉運體的影響等方面進行分析，并注意種屬差異。（七）報告完整的毒代動力學資料應包括對毒代動力學研究結果的自身評價和對毒性反應的相關解釋，并報告分析方法，說明分析中所選生物基質和分析物的理由。毒代動力學的結果分析中，應比較分析受試物和/或其代謝物的藥效、毒性、藥代和臨床擬定用藥的暴露量，采用暴露量來評估受試物的安全范圍。四、毒代動力學在不同毒性試驗中的應用毒代動力學研究在不同毒性試驗中的內容，如暴露監測和特征描述的頻度，可根據研究需要有所增減。不同毒性試驗的毒代動力學研究考慮如下：（一）單次給藥毒性試驗單次給藥毒性試驗的毒代動力學研究結果有助于評價和預測劑型選擇和給藥后暴露速率和持續時間，也有助于后續研究中選擇合適劑量水平。（二）重復給藥毒性試驗毒代動力學研究內容一般應納入重復給藥毒性試驗設計中，它包括首次給藥到給藥結束全過程的定期暴露監測和特征研究。后續毒性試驗所采用的方案可依據前