1、1. 基本原理基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無論是在理論上還是在設(shè)計上都是十分簡單和高效的。儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)附助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）

2、與離子的飛行時間成正比 ，檢測離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強有力的分析測試手段，并正扮演著越來越重要的作用。2 分子量測定 分子量是有機化合物最基本的理化性質(zhì)參數(shù)。分子量正確與否往往代表著所測定的有機化合物及生物大分子的結(jié)構(gòu)正確與否。MALDI-TOF是一種軟電離技術(shù)，不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的碎片離子。它可直接應(yīng)用于混合物的分析，也可用來檢測樣品中是否含有雜質(zhì)及雜質(zhì)的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白質(zhì)等鑒定中首要的參數(shù)，也是基因工程產(chǎn)品報批的重要數(shù)據(jù)之一。MALDI-TOF的準確度高達0.1%0.01%，遠遠高于目前常規(guī)應(yīng)用

3、的SDS電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，目前可測定生物大分子的分子量高達600KDa。 我們第一次獲得了SARS病毒N蛋白整體分子量我們測定的某納克級蛋白質(zhì)的分子量我們測定的某糖蛋白分子量某外資企業(yè)的新型日用化學(xué)品的分子量分布3. 蛋白質(zhì)組學(xué)中的質(zhì)譜技術(shù)肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)（PMF）蛋白質(zhì)組學(xué)是當前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。對蛋白質(zhì)快速、準確的鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的關(guān)鍵性的一步。采用MALDI-TOF-MS測得肽質(zhì)量指紋譜（PMF）在數(shù)據(jù)庫中查詢識別的方式鑒定蛋白質(zhì)，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最普遍應(yīng)用的最主要的鑒定方法。肽質(zhì)量指紋譜（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）

4、是蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質(zhì)量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)）都不同，當?shù)鞍妆凰夂螅a(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質(zhì)量指紋圖也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時，能耐受適量的緩沖劑、鹽，而且各個肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進行分析PMF的首選方法。在我們關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實際工作中，幾乎所有的發(fā)現(xiàn)均是從這一部開始做起來的！利用該技術(shù)鑒定的一系列蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)表在Oncogene、Clinical Cancer Research、Electrophoresis、Proteomics、中國科學(xué) 等一系列國內(nèi)外學(xué)

5、術(shù)期刊上。4. 蛋白質(zhì)組學(xué)中的質(zhì)譜技術(shù)肽序列標簽技術(shù)（PST）由于PMF鑒定結(jié)果的可靠性受諸多因素影響，使得部分鑒定結(jié)果往往不是十分明確，特異性不高。多肽氨基酸序列匹配被認為是特異性最好的鑒定方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，利用質(zhì)譜測序一般采用兩種方式：一種是利用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測序；另一種是利用源后衰變（PSD）技術(shù)測序。 在反射式MALDI-TOF-MS中，當脈沖激光照射到微量樣品與飽和小分子基質(zhì)混合形成的共結(jié)晶上時，能量通過基質(zhì)傳遞給樣品，導(dǎo)致樣品被解析電離，電離后形成的亞穩(wěn)分子離子在飛經(jīng)無場區(qū)（即飛行管區(qū)）時發(fā)生裂解（其活化能來自在離子源與基體發(fā)生的碰撞，在無場區(qū)與殘留氣體的碰撞，激光

6、輻射及各種熱機制等）所產(chǎn)生的子離子（即源后分解碎片離子），可以通過不斷改變反射器電壓來進行分離、收集并記錄于檢測器，形成能為多肽和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)提供十分豐富而有效的結(jié)構(gòu)信息的PSD質(zhì)譜圖。利用PSD譜圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以迅速、高特異性地鑒定蛋白質(zhì)。目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，部分經(jīng)2DE分離的蛋白質(zhì)樣品無法通過PMF鑒定或鑒定結(jié)果不明確，可將PSD測序功能應(yīng)用于這些蛋白質(zhì)的鑒定。隨著對PSD技術(shù)的不斷研究和發(fā)展，尤其是結(jié)合MALDI-TOF-MS本身所具有的高靈敏度、高通量、樣品靶點可多次應(yīng)用測定、分析時主要產(chǎn)生單電荷準分子離子以及能夠耐受一定量的鹽和干擾物等特點，PSD-MALDI-TOF-

7、MS將會在蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及藥物篩選的研究中發(fā)揮更大的作用。5. 寡核苷酸的分析隨著分子生物學(xué)技術(shù)和反義核酸藥物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的寡核苷酸片段被合成，用以作引物、探針以及反義藥物等。對這些片段進行快速檢測，以判斷合成的是否完全及合成的序列是否正確，是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在內(nèi)的生物質(zhì)譜是迄今為止進行這種檢測最好的手段。用MALDI-TOF-MS測定分析寡核苷酸，簡單、快速、準確、靈敏。結(jié)合3外切酶和5外切酶可以對寡核苷酸全序列進行測定。蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)NCBA蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)站是國家生物醫(yī)學(xué)分析中心一個主要針對電泳和生物質(zhì)譜技術(shù)的生物信息學(xué)網(wǎng)站。網(wǎng)站于2002年1月在中國互

8、聯(lián)網(wǎng)信息中心注冊，3月1日起正式對院內(nèi)外提供服務(wù)。現(xiàn)已初具規(guī)模，擁有了多種數(shù)據(jù)庫檢索、用戶數(shù)據(jù)查詢、軟件下載、分析技術(shù)方法、技術(shù)論壇、相關(guān)知識介紹等功能，并且仍在不斷的完善之中。在蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)中，我們現(xiàn)已初步建立了以下幾個數(shù)據(jù)庫：1. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫：主要由MALDI-TOF-MS、Q-TOF、Ion-Trap、GC-MS等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫組成。2.3.4. 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫： 本網(wǎng)站現(xiàn)安裝了SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。擴充的糖蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)以及其他特殊修飾的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)復(fù)合物等數(shù)據(jù)庫正在構(gòu)建中。5. Global Server蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索：該檢索系統(tǒng)是由Micromass公司開發(fā)基于

9、本地SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的檢索引擎，經(jīng)該公司授權(quán)，我們將其改為了基于Web的蛋白質(zhì)檢索系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過PMF和MS/MS數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)快速檢索和鑒定（約10秒左右），檢索結(jié)果不僅包含蛋白質(zhì)匹配的肽段，還提供譜圖模擬和匹配分布圖。 6.應(yīng)用文章摘錄1. Xia Q, Wang HX, Wang J, Zhang JY, Liu BY, Li AL, Lv M, Hu MR, Yv M, Feng JN, Yang SC, Zhang XM, Shen BF. Proteomic analysis of interleukin 6-induced differentiation

10、in mouse myeloid leukemia cells. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2005 (in press) 2. Jin BF, Wang HX, He K, Yu M, Hu MR, Yang SC, Shen BF, Zhang XM. Proteomic analysis of apoptosis triggered by inhibition of ubiquitin-proteasome pathway in M07e leukaemic cells. Cell Research,

11、2002, 12:271. 3. Jin BF, He K, Wang HX, Wang J, Zhou T, Lan Y, Hu MR, Wei KH, Yang SC, Shen BF, Zhang XM. Proteomic analysis of ubiquitin-proteasome effects: insight into the function of eukaryotic initiation factor 5A. Oncogene，2003 22:4819-4830. 4. Cui JW, Wang J, He K, Jin BF, Wang HX , Li W, Kan

12、g LH, Hu MR, Li HY, Yu M, Shen BF, Wang GJ, Zhang XM. Proteomics analysis of human acute leukemia cells: insight into their classifications. Clinical Cancer Research, 2004 Oct 15; 10(20):6887-96. 5. Cui JW, Wang J, He K, Jin BF, Wang HX , Li W, Kang LH, Hu MR, Li HY, Yu M, Shen BF, Wang GJ, Zhang XM. Two-dimensional electrophoresis protein profiling as an analytical tool for human acute leukemia classi