1、檢驗科微生物實驗室作業指導書和相關制度檢驗科微生物實驗室SO項件細菌室工作守則1. 每日工作前用紫外線照射實驗室半小時以上。2. 入室前應穿工作服，并做好實驗前的各項準備工作。3. 實驗室內應保持肅靜，不準吸煙、吃東西及用手觸摸面部。盡量減少室內活動，以免引起風動，無關人員禁入。4. 非必要物品禁止帶入實驗室，必要資料和書籍帶入后，應遠離操作臺。5.做好標本的登記、編號及試驗記錄。未發出報告前，請勿丟棄標本。6. 標本處理及各項試驗應在操作間進行，接種環用完后應立即火焰滅菌，沾菌吸管、玻片等用后應浸泡在消毒液內。7. 實驗時手部污染，應立即用過氧乙酸消毒或浸于3%來蘇兒溶液中5-10 分，再用

2、肥皂洗手并沖洗干凈; 如誤入口內，應立即吐出，并用1:1000 高錳酸鉀溶液或3%雙氧水漱口，根據實際情況服用有關藥物。8. 實驗過程中，如污染了實驗臺或地面，應用3%來蘇兒覆蓋其上半小時，然后清洗; 如污染工作服，應立即脫下，高壓滅菌。9. 若出現著火情況，應沉著處理，切勿慌張，立即關閉電閘，積極滅火。易燃物品（ 如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等） 必須遠離火源，妥善保存。10. 工作結束時檢查電器、酒精燈等是否關閉，觀察記錄培養箱、冰箱溫度及工作情況，用浸有消毒液的抹布將操作臺擦拭干凈，并將試劑、用具等放回原處，清理臺面，未污染的廢棄物扔進污物桶，有菌廢棄物應送高壓滅菌后處理。11. 離室前工

3、作人員應將雙手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗凈。12. 愛護儀器設備，經常清潔，注意防塵和防潮。細菌室消毒隔離措施1. 每天工作前用消毒液消毒工作臺，上班前、下班后開紫外燈（最少半小時）進行空氣消毒。2. 非必要品禁止帶入實驗室，必要資料和書籍帶入后，應遠離操作臺。3. 使用后的載玻片、蓋片、平皿、試管等用消毒液浸泡，經煮沸后清洗或丟棄。 4. 試驗后的血液標本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于試驗的反應板、吸頭等用消毒液浸泡（ 至少 24 小時以上 ） 后清洗或丟棄。5. 所有微生物培養物（ 細菌、支原體、真菌等培養物） ，不管標本陽性或陰性均用消毒液浸泡后，經煮沸消毒，才能清洗或丟棄。6.

4、取材、最好采用一次性工具，不能采用一次性工具者，每次取材前均應徹底消毒。 7. 用于浸泡各種器械如刮菌刀、持物鉗、鑷子等的消毒液要定期更換。8. 不慎發生臨床標本或培養物污染工作臺，不要立即用水沖洗，應先用紙巾、布等敷料加上消毒液（ 如 5%石炭酸、3%來蘇兒等） 消毒 30 分鐘以上，然后再清洗。如污染工作服，應立即脫下，高壓滅菌。9. 實驗時手部污染，應立即用肥皂洗手并沖洗干凈，再外用消毒藥水，如誤入口內，應立即吐出，并用1:1000 高錳酸鉀溶液或3%雙氧水漱口，必要時根據實際情況服用有關藥物。檢驗科 微生物實驗室安全與防護在工作區內禁止飲食，吸煙和存放食物及使用化妝品。實驗室里應保持整

5、潔，不存放與工作無關的雜物。工作臺每天至少用消毒劑清潔一次，在溢滲傳染物后要立即消毒、清洗; 進入無菌室必須穿工作服，戴口罩、帽子。在各種操作進程中均應盡量避免或減少氣溶膠產生。實驗工作區禁止無關人員出入，尤其要嚴禁兒童進入。凡發工作人員在處理傳染性物質或動物之后，以及在離開實驗室時要洗手。生溢漏事故或接觸傳染性物質后，均應立即報告實驗室監督員或實驗室主任，并做好書面記錄及采取相應措施。結核桿菌的培養及標本涂片務必在生物安全柜里操作。 9. 有涉及感染性材料的操作應在生物安全柜中進行，如結核桿菌培養、感染性組織等。10. 工作人員在進入實驗室工作區前，應在專用的更衣室（ 或緩沖間）穿著背開式工

6、作服或其它防護服。工作完畢后必須脫下工作服，不得穿工作服離開實驗室。可再次使用的工作服必須先消毒后清洗。11. 工作時必須戴手套（ 兩副為宜 ） 。一次性手套必須先消毒后丟棄。12. 在實驗室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用。可配備應急藥品。細菌室內質控制度每位工作人員必須加強質控意識，以質量控制工作為核心，認真做好各項質控試驗和記錄。加強質量控制和專業理論知識的學習，規范操作，正確分析處理結果。 一旦發現失控，及時采取相應措施，糾正失控結果。每批自配或購置的培養基、生化鑒定等試劑必須用標準菌株ATCC2785、 3ATCC25923 ATCC2592須控。合格方可使用

7、，并作好記錄。每周進行藥敏試驗質量控制。對每批微量藥敏板、培養基、藥敏紙片必須用ATCC27853 ATCC25923 ATCC25922g株進行質控，并做好記錄，出現問題及時分析，采用相應措施。每天觀察培養箱、CO邪養箱、冰箱的溫度，并做好記錄。無菌間每周監測一次，三氧機、紫外線消毒滅菌情況，并做好記錄。每三個月用 ATCC27853 ATCC25923 ATCC25922g株對全自動微生物分析儀進行鑒定和藥敏質量控制。認真討論、分析每次參加衛生部室間質評結果。總結經驗教訓。臨床微生物及實驗室的醫院感染管理檢驗科醫院感染管理應達到以下要求工作人員必須穿工作服, 戴工作帽 , 必要時穿隔離衣，

8、膠鞋，戴口罩, 手套。 使用合格的一次性檢驗用品, 用后進行無害化處理。嚴格執行無菌技術操作規程, 靜脈采血必須一人一針一管一巾一帶; 微量采血應做到一人一針一管一片; 對每位病人操作前洗手或手消毒。無菌物品如棉簽, 棉球 , 紗布等及其容器應在有效期內使用, 開啟后使用時間不得超過 24 小時 . 使用后的廢棄物品, 應及時進行無害化處理, 不得隨意丟棄。各種器具應及時消毒, 清洗 ; 各種廢棄標本應分類處理（ 焚燒, 入污水池, 消毒或滅菌 ） 。 報告單應消毒后發放。檢驗人員結束操作后應及時洗手, 毛巾專用, 每天消毒。保持室內清潔衛生. 每天對空氣, 各種物表及地面進行常規消毒. 在進

9、行各種檢驗時 , 應避免污染; 在進行特殊傳染病檢驗后, 應及時進行消毒, 遇有場地 , 工作服或體表污染時應及時處理, 防止擴散 , 并視污染情況向上級報告。菌種、毒種按傳染病防治法進行管理。實驗室的醫院感染管理參照檢驗科的管理要求. 實驗動物應嚴格管理, 防止逃逸或造成人與實驗室動物的交叉感染; 實驗后的動物必須焚化進行無害化處理。細菌鑒定和藥敏試驗操作按全國臨床檢驗操作規程。負責鑒定及簽發報告的主管技術人員應通曉診斷細菌學的全面知識。從事細菌專業技術人員，應了解醫院監測知識，掌握其檢測方法，定期統計分析醫院感染細菌分布，耐藥變遷，并將其結果反饋臨床。細菌室工作人員均應具備細菌傳染、消毒、

10、滅菌知識。細菌專業人員不斷更新知識，了解細菌學檢驗新進展。定期或隨時與臨床聯系，主動參與病例討論了解病情及治療情況，達到細菌檢驗與臨床的密切聯系。每天發出的微生物報告應認真復審，分析報告、評價報告。工作人員加強有菌觀念，無菌操作。當工作環境被細菌污染，必須立即消毒處理，報告主管人員，采取必要措施。10工作人員被細菌培養物污染應消毒處理，必要時給予藥物治療，并向主管負責人報告，采取特殊措施。無菌間規章制度每一個工作人員必須樹立無菌觀念，嚴格進行無菌操作。在無菌室內必須戴帽子、口罩，進行無菌操作。每天早上8:00 8:30 用紫外線消毒或在凌晨4-6 點用多功能機消毒2 小時，每月檢查一次紫外燈的

11、無菌效果。無菌室內各種廢棄物品必須煮沸消毒。實驗完畢后，用含氯制劑1000mg/L消毒桌面、地面。菌 （ 毒種） 管理辦法1. 菌種保管應有專人負責，保存于冰箱中，房門專人加鎖，確保菌種安全。保管人員變動時，必須嚴格交接手續。2、菌種應有嚴格的登記，包括形態，分離日期，鑒定日期，簽發者，主要鑒定性能 （ 包括形態、染色、抗原結構、動物致病力等） ，并注明使用、轉移、銷毀情況及原因。3、各種菌種應按規定時間接種，一般在接種三次后作一次全面的鑒定，注意菌種有無污染及變異，如發現變異時，應及時更換。4、菌種保存范圍及向外單位轉移，應按國家衛生部規定執行。5、所有存在菌種應具備清單。細菌室儀器維護保養

12、及質控措施我室主要儀器為 BacT/Alert 120、BACTEC905血培養儀和 Vitek-32、BD鳳凰全自動細菌鑒定和藥敏分析儀，為了使儀器能夠高質量的運行，使儀器報告的結果準確可靠，特制定以下儀器維護、保養和質控措施。一、BacT/Alert 120、BACTEC9050培養儀的維護、保養和質控措施 1.每天上班開始工作前和下班離開前要檢查儀器的工作狀態是否正常，儀器培養箱溫度的報告里外是否一致。2. 每天用中性的清潔液將儀器表面擦拭干凈3. 每天先做質控。4. 一個月至少做一次全程定標。5. 儀器檢測數據每周星期六做備份。6. 儀器每一個月做一次徹底的清潔保養，包括清潔外殼、瓶孔

13、、濾網等7. 儀器每年請工程師做一次檢定工作。二、Vitek-32、BD鳳凰全自動細菌鑒定和藥敏分析儀的維護、保養和質控措施1. 每天上班開始工作前和下班離開前要檢查儀器的工作狀態是否正常。2. 每天用中性的清潔液將儀器表面擦拭干凈3. 購買的新批號的試劑都必須先做質控，質控合格后才能用于臨床檢測。4.儀器檢測數據每周星期六做備份。5. 儀器每一個月做一次徹底的清潔保養，包括清潔外殼、卡片架、濾網等6.儀器每年請工程師做一次檢定工作。標準菌株保存及使用概述 : 標準菌株是細菌室室內質控工作必不可少的、重要的生物資源，我室的標準菌株主要來自省臨檢中心的發放和從衛生部臨檢中心以及國家菌種保存中心購

14、買所得，為了讓標準菌株能夠得到合理的應用，特制定以下規定。1. 對每批購買的標準菌株要做好登記，包括菌種的菌名、編號、購買時間、保存地點、記錄人等2. 每次使用標準品都應作好使用記錄，包括標準品的名稱、編號、使用時間等。 3. 購買的標準品初次使用時，應大量增殖，然后分裝在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉湯中，-20?以下保存。4. 新的標準菌株復蘇最多不得超過三次，如超過三次將不在視為標準菌株使用。 5. 標準菌株保存管一經溶化使用后，不得再次凍存。細菌室內務管理規定1. 細菌室崗位分工與職責管理規定1.1 概述鑒于細菌室工作瑣碎煩雜且千頭萬緒，為了使細菌室的工作能夠保質保量地順利完成，特將細

15、菌室暫定為兩個崗位，以明確工作范圍、增強責任心、便于日常工作的完成。當然由于細菌室不同崗位工作量的隨機性較大，故我室要求大家發揚既分工，又協作的精神，共同完成細菌室工作。1.2 崗位職責各崗位工作人員要求嚴格按照作業指導書進行操作，高質量的完成本崗位工作，如遇到問題須提出經討論解決。1.3 崗位分工崗位 ?: 完成細菌培養標本（? 號菌培養除外） 的結果觀察處理及報告發放。崗位 ?: 完成儀器的維護、保養和質控工作等。2. 細菌室記錄內容明細2.1 環境條件室內溫度、濕度，每天一次，上午記錄。2.2 恒溫設備2.3孵箱、普通冰箱，每天一次，上午記錄。2.3 分析儀器常規每日保養一次，發現問題隨

16、時詳細記錄; 質控按要求測試完畢后，及時手工記錄，2.4 標本與結果不合格標本記錄、危急值報告記錄、結果記錄。2.5 崗位記錄 （附表 : 細菌室崗位記錄表）2.6 其它記錄，如交班記錄等。3. 細菌室室內環境條件控制范圍溫度18,28?，濕度20,80, 。檢驗科作業指導書細菌室內務管理規定文件編號:LAB,SOP,JX011 第 2 頁，共 2 頁版本 :1生效日期:2005-11-01標本采集及保存要求1 總則 : 用于細菌培養的標本在收集時應注意嚴格無菌操作和及時送檢，檢測后標本應妥善保存。2 . 臨床標本的采集2.1 下呼吸道分泌物（痰液 ）令患者早上起床后用清水瀨口，不要刷牙，立即

17、從下部呼吸道咳出第一口痰，吐在無菌塑料痰盒中，及時送檢。2.2 尿液 （中段尿 ）護理人員協助采取中段尿約3ml 入無菌試管中，及時送檢。2.3 糞便 : 取有粘液、膿血部分的糞便置玻璃大便專用管中，如為稀水便，可直接收集于玻璃管中，及時送檢。2.4 眼、耳、鼻、喉拭子: 將棉拭子沾取少許無菌生理鹽水（如沾取的太多，可在無菌生理鹽水瓶壁上擠去多余的水份） ，然后采取可疑部位的分泌物，倒懸于無菌試管內, 及時送檢。2.5 膿液 : 用沾有生理鹽水的棉拭子沾取膿液，要盡量多取一些，然后將棉拭置于無菌試管中，及時送檢。2.6 血液 :2.6.1 凡懷疑菌血癥和敗血病的患者，采血培養時，應盡量在未使用

18、抗菌素前采血，如已使用抗菌素，應盡量選擇抗菌素在體內濃度最低時采血，應在病人第二次使用抗菌素之前采集血培養標本。當然在病人發熱或寒顫時采集也可。2.6.2 成人每次采血 510ml,小兒采血23ml;2.6.3 嚴格消毒病人采血部位和血培養瓶口，抽一定量血液后，無菌注入血培養瓶內，輕輕搖勻，2.6.4 從抽血到接種入瓶，動作要快，防止血液凝固，同時要及時送檢。2.7穿刺液 : 胸腹水、心包液、關節腔液、鞘膜積液:嚴格無菌抽取后，注入含肝素抗凝的無菌試管中，輕輕顛倒試管10 余次，使肝素與穿刺液混勻達到抗凝的目的，或直接無菌注入血培養瓶內及時送檢。2.8 膽汁：由專科醫生以無菌方法取引流液10m

19、l注入無菌試管。2.9 腦脊液：以無菌方法取腦脊液3-5ml,置無菌試管內，常溫保存送檢，如只 做培養可直接無菌注入血培養瓶內，及時送檢。2.10 生殖器官標本: 陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應由醫師采集，收集于無 菌試管內送檢。如疑為淋病奈瑟菌感染，做培養檢查時，采集的標本應床旁接種并及時放入孵箱培養。 2.11 燒傷標本: 以無菌棉拭子直接采取多個部位創面的膿汁分泌物放入無菌試管中 . 2.12 支原體 (解脲、人型)培養 +藥敏的標本采集2.12.1. 支原體對干、熱抵抗力差，標本采集后應盡快接種支原體運送培養基送檢。 2.12.2 男性 : 用細的無菌棉拭子沾取無菌鹽水少許深入尿道口內

20、2.5-3cm。3. 臨床標本的保存細菌室標本原則上要求及時送檢、及時處理，不得保存。細菌室室內質控失控處理程序一、 BacT/Alert 120 血培養儀室內質控處理程序1( 當 BacT/Alert 120 血培養儀質控失敗時，2( 儀器會提示你對該瓶孔進行定標， 3( 通常定標4( 都能通過，5( 只要定標6( 過了， 7( 儀器就能正常工作。8( 如儀器定標9( 不 10( 能通過，11( 就要請廠家工程師對儀器進行檢測，12( 并對儀器的有關參數進行調整，13( 直到儀器合格后才能進行日常工作并填寫失控報告Vitek-32 細菌鑒定及藥敏分析儀室內質控處理程序14( 每批新購買的試劑

21、必須進行室內質控，15( 當質控結果不16( 能符合要求時， 17( 應通知組長協助處理，18( 進行失控原因分析。19( 失控原因分析與處理2.1 失控的原因分析2.1.1 自身原因2.1.1.1 質控菌株、卡片、無菌鹽水等出現質量問題。2.1.1.2 質控菌株不符合所檢測卡片的要求。2.1.1.3 上卡操作中出現問題，如菌液濃度不準等2.1.1.4 儀器工作是否正常。2.1.1.5 室溫是否符合分析要求。2.2 失控的處理2.2.1 操作不規范時應嚴格按作業指導書重新檢測一次。仍失控進行下一步。2.2.2 檢查質控菌株及卡片是否在有效期內，質量如何, 無菌鹽水是否被污染以及標準菌株是否符合

22、卡片的要求等。在保證質控菌株、卡片、無菌鹽水等符合要求的情況下仍失控則進行下一步。2.2.3 做可能影響檢測的儀器相應部分保養，仍失控進行下一步。2.2.4 請儀器工程師分析。寫失控報告。直到質控在控后重新檢測。標本拒收標準1. 支原體培養、鑒定、計數、藥敏操作: 若送檢標本不是運送培養基送檢則為不合格標本。2. 找抗酸桿菌: 穿刺液標本如發現嚴重凝固則拒收。3. 腦脊液培養: 如標本為非無菌管采集則拒收。4. 中段尿培養: 如標本為非無菌管采集則拒收。5. 下呼吸道標本培養：挑取痰標本直接涂片鏡檢，WBC,10/LP上皮細胞，25/LP不適合做細菌培養。6. 膿液及創傷分泌物培養: 如標本為

23、非無菌管采集則拒收。7. 穿刺液培養: 如標本為非無菌管采集則拒收。8. 生殖道分泌物培養: 如為淋球菌培養沒有直接接種到淋球菌培養基上則拒收。 9. 各類培養標本原則上都要求無菌采集并及時送檢、及時接種、及時培養，不能保存。除非特殊情況可置于冰箱保存，對分離怕冷的細菌時，應注意標本的保暖。溫度失控處理措施1. 每天上班記錄培養箱、冰箱的溫度于溫度記錄本上，如發現普通培養箱的溫度超過 37?（不包括 37?）或低于34?（不包括34?）; 真菌培養箱溫度超過31?（不包括31?） 或低于25?（不包括25?）; 冷藏冰箱的溫度超過8?（不包括 8?）或低于2?（不包括 2?）; 冷凍冰箱的溫度

24、超過-10?（ 不包括 -10?） 或低于 -30?（ 不包括 -30?） ，應立即追溯其失控的時間和原因。1.1 如失控的原因可以馬上糾正（ 如冰箱斷電、冰箱門未關好、溫控調節器未正確控制、冰箱嚴重結霜、溫度計損壞等） ，則由本室人員馬上糾正并填寫失控報告。 1.2 如冰箱、培養箱本身出現機械故障，本室人員應馬上通知維修部或維修商，同時根據排除故障時間的長短是否會對其中的物品質量造成影響而采取相應的措施 （ 如把里面的物品轉移到能滿足需要條件的環境中） ，并填寫失控報告單。2. 培養箱中的培養物應全部拿到工作臺，檢查培養物的生長情況。2.1 . 如果培養基的菌落生長良好，則按常規程序進行檢驗

25、。2.2 （ 如果培養基的菌落生長受抑制，則取標本重新接種，如標本確實無法再次接種，則應與臨床醫生聯系、解釋并請醫生重新采集標本送檢。2.3 （ 如有細菌生長，則應補做藥敏試驗，并填寫遲發報告單記錄表，并寫明原因。3. 故障處理過程中應及時貼上紅色標識，并在溫度記錄本上用紅筆記錄失控的溫度度數，故障處理后應利用培養箱、冰箱的溫度調節器，把溫度調回到規定范圍的中值，并把專業人員的檢查的結果記錄在儀器檔案袋中。另外還需填寫內部質量控制失控報告單，當溫度再次是失控時，再次記錄溫度的讀數，并且上報負責人。超凈工作臺1. 目的 規范凈化工作臺操作與維護工作，確保儀器正常運作。2. 適用范圍: 本實驗方法

26、適用于微生物檢驗中凈化工作臺操作與維護管理。3.檢驗人員職責: 負責此儀器操作和維護管理4. 操作及維護規程4.1 操作規程4.1.1 使用工作臺時，應提前50分鐘開機，同時開啟紫外殺菌燈，處理操作區內表面積累的微生物，30 分鐘后關閉殺菌燈（ 此時日光燈即開啟） ，啟動風機。4.1.2 對新安裝的或長期未使用的工作臺，使用前必需對工作臺和周圍環鏡先用超靜真空吸塵器或用不產生纖維的工具進行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進行滅菌處理。4.1.3 操作區內不允許存放不必要的物品，保持工作區的潔凈氣流流型不受干擾。 4.1.4 操作區內盡量避免作用明顯擾亂氣流流型的動作。4.1.5 操作區

27、的使用溫度不可以超過60?。4.2 維護規程及維護方法4.2.1 根據環境的潔凈程度，可定期（一般 2,3 個月 ）將粗濾布 （滌綸無紡布）拆下清洗或給予更換。4.2.2 定期 （一般為一周）對環境周圍進行滅菌工作，同時經常用紗布沾酒精或丙酮等有機溶劑將紫外線殺菌燈表面擦干凈，保持表面清潔，否則會影響殺菌效果。4.2.3當加大風機電壓已不能使風速達到0.32m/s 時必須更換高效空氣過濾器。4.2.4更換過濾器時，可打開頂蓋，更換時應注意過濾器上的箭頭標志，箭頭指向即為層流氣流向。4.2.5 更換高效過濾器后，應用Y09-4 型塵埃粒子計數器四周邊框密封是否良好，調節風機電壓，使操作區平均風速

28、保持在0.32-0.48m/s 范圍內，再用Y09-4型塵埃粒子計數器檢查潔凈度。標本的接種和移種法接種標本是細菌實驗室的一項基本操作技能，目的是使細菌能得到充分的生長和能分離出單個菌落獲得純培養而供分析鑒定之用，所以作此項技術的操作應按以: 1. 左手的操作要點: 左手負責持平板、試管、燒瓶等物品，操作中，左手應盡量減少擺動，否則，不利于保持物品的無菌狀態。1.1 左手持物品時，最好固定在一個空間方位上，以避免因移動使空氣中的細菌進入器皿，造成隨機性污染。1.2 所持的器皿其開口盡量避免向上，持平皿時，可以讓平板的表面與地面盡量垂直，試管與器皿燒瓶也可傾斜。當從標本器皿或平板上挑取接種物或菌

29、落后應立即塞上試管塞或扣上平皿，隨即接種標本。2. 右手的操作要點: 握有接種工具的右手，將接種環或針沿伸到標本之前應作好接種環或針，鑷子等工具的火焰消毒工作，待冷卻后才沿伸到標本容器中挑取接種物，在挑取標本后，其接種工具應盡量避免接觸試管壁及試管口等。隨后將接種物在培養基上分離劃線。3. 移種或接種的基本步驟:2.1 右手持接種工具，在火焰上燒灼3次滅菌。2.2 左手持起標本容器或原代培養物的平皿或試管等。2.3 用接種工具挑取適量標本或細菌，挑取標本時，應注意選擇真實反映感染情況的部分，如糞便挑取粘液膿血部分。純化細菌應從原代培養物上挑取單個菌落。從液體培養基中取菌，只需將接種環在培養液中

30、蘸取一環即可。2.4 接種時可根據要求采用不同的接種方法。2.5 接種后，應在火焰上反復燒灼接種工具并作一定的編號記錄，所用工具應放回原處。常用分離培養基2.6 用分離培養基種類：血平板、巧克力平板、麥康凱平板、 SS平板、克氏雙 糖鐵(KIA)、M-H培養基、4 號培養基、念珠菌藥敏 養基、 念珠菌藥敏平板。 2. 平板培養基均由鄭州博賽、杭州天和藥業公司生產。3. 生產批號:4. 用途 :4.1 血平板適用各類細菌生長，為一般細菌標本接種常用培養基。4.2 巧克力平板適用于某些血平板生長不良或需嗜血因子細菌的培養。4.3 麥康凱平板作初步是否發酵乳糖鑒定之用，主要用于糞便標本分離培養及作非

31、發酵菌生長試驗用。4.4 SS 平板主要用于糞便標本分離培養及非發酵菌生長試驗之用。4.5 克氏雙糖鐵(KIA) 主要用于觀察細菌是否發酵葡萄糖、乳糖產氣產酸，是否產生H2s及觀察動力。4.6 M-H 培養基主要用于藥敏試驗。4.7 營養瓊脂平板用于菌種保存、純分離及作空氣培養。4.8 沙保氏培養基用于真菌培養。5( 質控 : 每次用標準菌株進行生長試驗和抑菌試驗質控。質控合格后，方可使用，并認真做好記錄。6( 注意事項:6.1 對每批培養基必須檢查: 平皿的裂紋、充碟不均、培養基裂紋、溶血(血平板 ) 、冷凍、過多的氣泡或斑點、污染等。6.2 缺陷性報告: 如果發現培養基有缺陷，實驗室應做好

32、記錄并通知制造商，制造商應有適當的改進措施，并記錄在案。細菌室標本操作流程1. 標本的接受1.1 標本接受的時間: 原則上全天任何時間均可。1.2 標本的接受: 接受標本者要認真核對標本的數量、標本與檢驗單要求是否相符以及標本的質量等。1.3 把接受的標本編號。2. 臨床標本的接種2.1 檢驗目的為細菌培養+藥敏試驗的各臨床標本的培養基選擇2.1.1 標本類型培養基血 血培養瓶中段尿血平板、麥康凱平板、L菌平板腦脊液血培養瓶、血平板、巧克力平板穿刺液血培養瓶、血平板、麥康凱平板、巧克力平板膽汁 肉湯、血平板、巧克力平板、麥康凱平板呼吸道標本血平板、麥康凱平板、巧克力平板糞便標本SS平板、MAC

33、f板和血平板病灶分泌物血平板、巧克力平板、麥康凱平板2.1.2 生殖器標本根據臨床醫生所寫的檢驗項目接種相應的平板及操作: 淋球菌培養接種淋球菌平板; 念珠菌培養接種沙保羅培養基; 支原體培養則按支原體培養的操作規程操作; 作普通細菌培養, 則接種血平板和巧克力平板; 衣原體抗原檢測的按衣原體抗原檢測的操作規程進行檢驗2.2 接種的方法: 中段尿標本無菌取10ul ，在血平板的中間做垂直劃線，然后分離劃線。其他標本做分區劃線。2.3 檢驗目的為找抗酸桿菌的按找抗酸桿菌的操作規程進行檢驗。3. 所接種的平板必須寫上標本的編號和接種的日期，然后根據要求進行培養。4. 標本的培養條件、溫度、時間平板

34、 培養條件、溫度、CO寐度、時間血平板CO2孵箱、35-37?、18-24小時巧克力平板CO2孵箱、35-37?、18-24小時淋球菌平板CO2孵箱、35-37?、18-24小時沙保羅平板CO2孵箱、28-31?、24-36小時其他的平板CO2孵箱、35-37?、18-24小時5. 根據生長在平板上的細菌菌落形態、菌落涂片、染色、鏡檢等來綜合判斷細菌形態和染色性質，按各屬鑒定的作業指導書進行各菌屬的常規鑒定及藥敏試驗。6. 結果的報告確認細菌鑒定及藥敏試驗結果后，進行檢驗驗單結果報告的存盤、打印。7.對各類細菌培養標本除特殊要求外，我室細菌標本在接種后每天按要求進行無害化處理。二氧化碳培養法目

35、的是用于分離和培養需CO2H體生長的細菌或只有在CO2W境中細菌生長形態典型的細菌。一般臨床細菌實驗室須配備一個 CO邪養裝置，其一為專用的CO2培養箱，其二為燭缸CO2環境。一般實驗室兩者必須具備其一。我室采用 CO2ff箱。做法如下：調節CO2孵箱正面的溫度調節鈕，使其溫度在 35+1現圍。調節CO2孵箱正面的CO2a度調節鈕，使其CO2»度在5-10%范圍。將種有標本的平板放入CO2W箱培養。關好孵箱門，避免由于門未關好造成的溫度、CO寐度低于允許范圍。分離及純化法1. 分離是指從原材料或多種細菌的混合培養物中將各種細菌彼此獨立地分離開，以得到純的單一菌株，技術步驟如下:作純培

36、養分離時，一般只用一只完整的瓊脂平板。涂劃多采用分區劃線法，在一只平板中可劃3,5 個區。劃法有兩種: -1.1 從臨床標本分離細菌所含菌數相對較少時，可用接種環取標本涂布在平板一角邊緣，然后從此區開始劃線至1/3平板，為第一區，再在2、3區依次劃線每劃完一個區域均將接種環滅菌一次，冷卻后再劃下一區域，每一區域的劃線均接觸上一區域的接種線12次，使菌量逐漸減少以獲得單個菌落。1.2 快速劃線分離法: 采用快速劃線使一接種環標本能分離出單個菌落，這與標本的菌量及操作者的技能有很大關系。2. 純化是指欲獲得大量純培養物的方法，所用平板大小可根據需要的菌量而定。方法是將一單個菌落或將相同的菌落作大量

37、密集涂劃于平板上而獲得大量純的培養物。顯微鏡檢查法顯微鏡檢查是細菌鑒定工作中的一重要手段，有助于細菌的初步鑒別，同時對下一步鑒定工作起著重要的指導作用。有時通過形態學檢查可得到初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。顯微鏡檢查有不染色標本檢查法和染色標本檢查法兩種。1. 不染色標本的檢查: 不染色標本主要用于檢查細菌的動力及運動狀況。1.1 壓滴法 : 用接種環取細菌懸液2環，置于清潔載玻片中央，覆上蓋玻片，于高倍鏡下觀察。制片時菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。1.2 懸滴法 : 取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各1 塊，將凹孔四周的平面上涂上一層凡士林，取一環菌液置蓋玻片中

38、央，將凹窩載玻片的凹面向下，對準于蓋玻片的液滴上，然后迅速翻轉玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片使之與凹孔邊緣粘緊。鏡下觀察時先低倍后高倍，不可壓碎蓋玻片。有動力的細菌可見細菌從一處移到另一處，無動力的細菌呈布朗運動而無位置的改變。螺旋體由于菌體纖細、透明，需用暗視野顯微鏡觀察其形態、活動。2. 染色標本檢查法: 通過對標本的制片及染色，能觀察細菌的形態、大小、排列、染色特性以及莢膜、芽胞、異染顆粒等結構，有助于細菌的初步鑒定。2.1 快速革蘭染色法2.1.1 操作見試劑說明書2.1.2 結果 : 革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。2.1.3 注意事項: 染色關健在于涂片和脫色，涂片不宜過厚，固定

39、不宜過熱，脫色不宜過度，菌齡為 18,24 小時為佳。2.2 抗酸染色法2.2.1 操作見試劑說明書2.2.2 結果 : 抗酸桿菌呈紅色。2.2.3 注意事項 : 每一張玻片只能涂一份標本且不能在染色缸中染色，以免造成不同標本間的交互污染從而導致陰陽性結果混淆，脫色時間寧長勿短，至無紅色液體流下為止。2.3 阿爾培異染顆粒染色法:2.3 .1 初染 : 涂片上滴加第一液染劑（甲苯胺藍和孔雀綠的乙醇溶液），染 3-5 分鐘，水洗。2.3.2 復染 : 第二液染劑（碘化鉀溶液）染 1 分鐘，水洗。自然干燥后鏡檢。 2.3.3 結果 : 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色。2.4 .4 注意事項 : 玻片

40、要清潔，染料需新鮮配制，無沉淀物。注意與標本中的其他雜質相區別。3. 壓片鏡檢，主要觀察細菌在組織中的分布。4. 墨汁負染鏡檢: 背景著色而菌體不著色的染色法，用以觀察新型隱球菌的寬厚莢膜等。5. 鞭毛染色鏡檢，觀察細菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的數量，在非發酵菌的鑒定中是一項重要的指標。6. 暗視野鏡檢: 觀察一些較微小且有一定結構的微生物，如鉤端螺旋體的鉤狀及螺旋的形態等。7. 制動試驗的直接鏡檢，在標本加入抗血清，觀察動力是否被抑制，如霍亂弧 菌的制動試驗等。8. 熒光鏡檢，用標有熒光素的物質與檢材中的微生物特異結合產生熒光的特點而對微生物作出鑒定。穿刺液標本的細菌學檢驗1. 標本采集1

41、.1 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、關節液及鞘膜液等。1.2 一般由臨床醫師以無菌操作穿刺術抽取。胸腹水抽取5,10 毫升，心包液、關節液等可抽取2,5m1,將所取得之樣本注入含有抗凝劑的無菌管內充分混勻后送檢。1.3 標本采集最好能在停藥2 天后進行，如不能停藥，則應在下次用藥前采集，如疑為淋病性關節炎患者，其標本應在采集后立即送檢或床邊直接接種，切不可放冰箱保存。2. 檢驗步驟2.1 涂片檢查標本 3000r/min 離心 l5 分鐘后，取沉淀物制片。2.2 涂片鏡檢的細菌常為一般致病菌、革蘭氏陰性雙球菌和抗酸桿菌等，涂片檢查應根據項目要求進行相應的染色鏡檢。2.3 培養 : 作一般細菌培

42、養可把采集的標本接種于血平板、麥康凱、巧克力平板，同時也可將標本注入血培養瓶放入血培養儀培養。2.4 作厭氧培養可采用直接床邊接種標本或采集樣本后，將培養物直接注入厭氧增菌培養基。3. 操作流程穿刺液厭氧涂片革蘭氏染色需氧注入血培養瓶厭氧平板血平板放入血培養儀厭氧肉湯初步報告麥康凱陽性報警巧克力 分離培養涂片染色Vitek-32 鑒定、藥敏/BD 鳳凰鑒定、藥敏確定報告4. 報告結果4.1 涂片報告發現形似某某細菌，淋球菌應報是否在細胞內外發現革蘭氏陰性雙球菌 ; 抗酸染色應報是否發現抗酸桿菌。4.2 用于培養的穿刺液正常情況下應無菌，如培養出細菌應報細菌種名及藥敏試驗結果，血培養儀培養6 天

43、仍未發現細菌則報無菌生長。膽汁標本的細菌學檢驗膽汁培養常見病原菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌腸球菌 大腸埃希菌消化鏈球菌肺炎克雷伯氏菌葡萄球菌變形桿菌產氣腸桿菌銅綠假單胞菌傷寒及其它沙門菌擬桿菌糞產鹼桿菌2. 標本收集膽汁標本的采集方法有三種，即十二指腸引流法，膽囊穿刺法及手術直接采取法。 2.1 十二指腸引流法: 在無菌操作下用導管作十二指腸引流膽汁，分為A、 B、C三部分。A液來自膽管，為橙黃或金黃；B液來自膽囊，為棕黃綠色；C液來自肝膽道，為檸檬色。一般認為B 液做細菌培養意義較大。2.2 膽囊穿刺法: 進行膽囊造影時同時采取膽汁。本法所采取的膽汁不易被污染，適宜做細菌培養。2.3 手術采取法:

44、 在進行膽部外科手術時直接采取膽汁送檢。3. 檢驗步驟3.2 將送檢標本3000r/min 離心 30 分鐘，傾去上清液取沉淀物涂片及培養。3.3 膽汁一般不作涂片檢驗，如需要應用相應的染色方法檢查并仔細觀察，因為膽汁沉淀后有較多的內容物復蓋而不利于觀察細菌。3.4 培養提倡直接將膽汁注入血培養瓶進行增菌培養。培養標本也可直接種血平板、麥康凱平板和巧克力平板。4. 操作流程膽汁需氧 血培養瓶增菌涂片染色血平板、巧克力平板血平板、巧克力平板初步報告麥康凱菌落觀察涂片染色Vitek-32 鑒定、藥敏/BD 鳳凰鑒定、藥敏確定報告5. 報告結果5.2 沙門氏菌感染在膽汁中檢出率較高，但必須以血清凝集

45、試驗為依據報告血清型。 5.2 膽汁應是無菌的，如培養出細菌即為致病菌應報細菌的種屬及藥敏試驗結果。糞便標本的細菌學檢驗1. 糞便標本中常見病原菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌傷寒及其它沙門菌結核分支桿菌志賀菌屬難辨梭菌致病大腸埃希菌白色念珠菌（ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC）弧菌屬菌種氣單胞、鄰單胞菌種小腸結腸炎耶爾森菌彎曲菌2. 標本采集2.1 自然排便采集法 自然排便后，挑取膿血、粘膜部分的糞便2,3g,液體糞便取絮狀物置于大便培養管或增菌液中送檢。2.2 直腸肛管法 用大使培養用的肛管直接插入肛門成人4,5cm,幼兒2,3cm,輕輕在直腸內旋轉數次，目的是使直腸表面粘

46、液能通過肛管孔進入肛管內。然后拔出放入大便培養管中送檢。3. 檢驗步驟3.1 涂片檢查糞便標本因各種正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有懷疑霍亂弧菌及菌群失調所致腹瀉時，才作直接涂片檢查。3.2 各項的涂片檢驗均按染色方法進行，但大便檢查霍亂弧菌有其處理程序:3.2.1 染色檢查 : 將米泔樣的標本涂2張片用乙醇固定后染色，目的觀察弧菌有無呈魚群狀排列。3.2.2 懸滴檢查取患者糞便制成懸滴涂片，霍亂弧菌和EI tor 弧菌均呈現極活潑的穿梭狀運動。3.2.3 制動檢驗運動活潑的弧菌涂片加人霍亂弧菌診斷血清后，在顯微鏡下觀察，若原運動活潑的現象停止，為制動試驗陽性。3.3 大便標本

47、的培養目的是培養致病菌或追蹤病人有否菌群失調現象，無特殊要求作一般致病菌培養的標本接種麥康凱、SS平板各一個。3.4 菌群失調的細菌學檢驗：選用多種培養基包括SS麥康凱、血平板、高鹽 甘露醇鹽瓊脂平板、Campy-BAto瓊脂平板和沙氏瓊脂等，目的是使更多的菌群得 到生長，以利于檢查腸道的細菌情況。3.5 霍亂弧菌的培養，直接取患者米泊樣糞便 0.5ml ,接種于堿性蛋白陳水增 菌液和4號平板，35?培養6,8h ,再轉種一只4號平板。35?培養18,24h后形成較 大、菌落中間為灰黑色、有光澤、隆起、濕潤的菌落，如潑水狀。挑取可疑菌落5,10個與霍亂多價" O'診斷血清作玻

48、片凝集試驗，如為陽性，則立即報告，并將可疑菌送成都市疾病控制中心確認。3.6 作結核菌培養應先處理（參照雜菌處理方法篇章介紹）后種入改良羅氏培養基中或 magot培養基。3.7 厭氧性難辨梭菌的培養參照厭氧培養。3.8 真菌培養: 真菌性腹瀉多繼發于抗生素治療后，常見的真菌腹瀉多由白色假絲酵母菌引起。將標本接種于沙氏平板及血平板上，置 27?和35?培養18,24h,根 據形態染色、菌落特征或采用 VITEK-32 YBC或API Aux半自動條鑒定，并做 ATB Fungus藥敏試驗。4.操作流程糞便或肛拭子增菌培養分離培養涂片檢查沙門氏菌、志賀氏菌35?18,24h霍亂弧菌SS麥康凱平板革

49、蘭氏染色觀察動力沙氏斜面、血平板等菌落觀察涂片檢查血清學鑒定Vitek-32 鑒定、藥敏/BD 鳳凰鑒定、藥敏確定報告5. 報告結果: 查出腸道致病菌，報告其菌名和藥敏結果。如為致病性大腸埃希菌必須以血清學診斷試驗為鑒定依據，報告應包括ETEC、 EPEC、 EIEC、 EHEC。6. 糞便中培養出霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌時應作為危急值報告，并填寫幾危急值報告單。血液及骨髓標本的細菌學檢驗血液及骨髓標本中常見病原菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌肺炎鏈球菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌傷寒及其它沙門菌表皮葡萄球菌變形桿菌溶血性鏈球菌產氣腸桿菌糞腸球菌肺炎克雷伯氏菌銅綠假單胞菌糞產鹼桿菌沙雷氏

50、菌流感嗜血桿菌布魯氏菌2. 標本采集2.1 采血時間 : 在病人發熱初期1-2 天內或發熱高峰時采集血液標本。采血時間原則上應選擇在抗菌藥物應用前, 對已用藥而又不能中止用藥的病人，應在下次用藥前采集。2.2 標本采集方法及標本量成人每次采血10ml,嬰幼兒每次采血1-5ml。嚴格無菌采集的血液標本應立即加入血培養瓶內，迅速輕搖，使之充分混合，以防血液凝固。對于疑為細菌性骨髓炎病人，應在嚴格消毒后抽取骨髓1ml 然后注入小兒瓶中進行增菌培養。3. 操作流程血液無菌注入血培養瓶2.3 天無菌生長增菌培養血平板 陽性報警巧克力平板無菌生長發陰性報告涂片染色血平板初步報告巧克力平板（5%CO條件）3

51、5-37?， 18-24 小時菌落觀察、涂片染色及相關酶試驗Vitek-32 鑒定、藥敏/BD 鳳凰鑒定、藥敏確定報告檢驗科作業指導書血液及骨髓標本的細菌學檢驗文件編號:LAB,OP,XJ026 第 2頁，共2頁版本 :1生效日期:2005-11-014. 報告結果4.2 血4.1 在血液中檢出沙門氏菌，必須以血清凝集試驗為依據報告血清型。液正常情況下應是無菌的，如培養出細菌即為致病菌，應報細菌的種屬及藥敏試驗結果。4.3 血培養陽性均作為危急值報告，并填寫危急值報告單。編寫 : 審核 : 批準 :批準日期:2005 年 11 月 01 日腦脊液的細菌學檢驗腦脊液培養常見病原菌革蘭陽性菌革蘭陰

52、性菌金黃色葡萄球菌腦膜炎奈瑟菌A、B群鏈球菌卡他布蘭漢菌肺炎鏈球菌流感嗜血桿菌結核分支桿菌腸桿菌科菌種產單核李斯特菌腦膜敗血性黃桿菌新型隱球菌假單胞菌白色念珠菌2. 標本收集:2.1 標本必須由臨床醫師以無菌操作收集腦脊液3,5ml ，盛于無菌管中送檢。腦脊液中某些細菌（ 腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等） 易死亡，故收集標本后應立即送檢。切不可低溫（ 冰箱 ） 保存。3. 檢驗步驟:3.1 一般細菌涂片檢查除結核性腦膜炎外，由其它細菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無色透明的腦脊液，應離心后涂片、染色、鏡檢，根據染色及形態特征可初步提示細菌的種類。結核分

53、枝桿菌涂片檢查 : 取腦脊液的離心沉淀物(3000r/min,30min) 作抗酸染色。新型隱球菌涂片檢查取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負染色。3.2 分離培養用接種環挑取混濁腦脊液或經離心沉淀的沉淀物，分別接種于血平板、巧克力平板，巧克力平板應置于CO冰境中35?培養18,24小時。腦脊液也可直接注入血培養瓶放入BacT/Alert 120 或 BACTEC 9050中進行監測。4. 檢驗流程:腦脊液3000r/min 10,15min 3000r/min 10,15min肉眼觀察BacT/Alert 監測 培養檢查涂片檢查陽性報警血平板巧克力平板(5,10%CO2)5 天無菌生長報陰性觀察菌落

54、墨汁染色革蘭氏染色抗酸染色涂片檢查血清學試驗Vitek-32 鑒定、藥敏/BD 鳳凰鑒定、藥敏確定報告5. 報告結果: 檢出細菌，應報告菌名和藥敏結果，血培養儀培養6 天仍無生長者則報告陰性。6( 陽性培養結果應作危急值報告，并填寫危急值報告單。尿液的細菌學檢驗1. 尿液培養常見病原菌革蘭陽性菌革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌淋病奈瑟菌腸球菌 大腸埃希菌A群鏈球菌變形桿菌腐生葡萄球菌肺炎克雷伯菌表皮葡萄球菌產氣腸桿菌結核分支桿菌沙門菌種銅綠假單胞菌沙雷菌2. 標本收集:2.1 尿液標本的采集可采用多種方法: 有中段尿采集法、膀胱穿刺法、腎盂尿采集法，而常規是取中段尿作細菌培養。2.2 取中段尿作培養時先要進行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染標本。 2.3 如采用其他方法收集標本，必須由臨床醫生根據臨床診斷需要而執行收集術，并在檢驗單上寫明。3. 檢驗步驟:3.1 涂片檢查3.1.1 一般細菌及淋病奈瑟菌涂片: 以無菌操作吸取尿液10ml， 3000r/