1、    阿霉素合用化療耐受逆轉劑對腎癌 細胞的體外逆轉試驗        【摘要】目的探討逆轉腎癌細胞對化療藥物的耐受。方法采用四種不同類型的逆轉劑：異博定、Buthionine sulfoximine (BSO)、三苯氧胺、環孢素A，以單藥或多藥組合的方式與阿霉素聯合應用，與腎癌細胞共同培養。MTT染色法檢測細胞生長抑制率。結果單藥應用中以異博定的逆轉效果最好，對腎癌細胞生長抑制率達34%(P0.05)，多藥組合中以異博定+BSO+三苯氧胺更為有效，對腎癌細胞生長

2、抑制率達50.8%(P0.05)。結論多藥組合逆轉較單藥應用更為有效。兩種不同逆轉機制的逆轉劑聯用，較兩種同為P-170的逆轉劑聯用效果更好。【關鍵詞】腎腫瘤癌藥物耐受性 Combined use of doxorubicin and modulators to revert the multidrug resistance of renal cancer cell lineREN Laicheng,XUE Zhaoying,YU Lizhang.Department of Urology,the Second Affiliated Hospital,Shanxi Medical Univer

3、sity,Taiyuan 030001【Abstract】ObjectiveTo revert the multidrug resistance of renal cancer cell line (GRC-1).Mathods4 modulators (verapamil,tamoxifen,buthionine sulfoximine (BSO),cyclosporin A) have been used combinedly with doxorubicin in culturing with GRC-1.MTT staining assay was carried out to mea

4、sure the reversal of the drug resistance by the modulators.ResultsAmong the single modulator regimens,ve-rapamil revealed the strongest reversal effect on drug resistance,the human renal cancer cell line inhibition rate being 34% (P0.05).Among the multimodulator regimens,verapamil+tamoxifen and BSO

5、was the more effective,the inhibition rate being 50.8% (P0.05).ConclusionsMultimodulator regimen was more potent than the single modulator regimen.Using 2 modulators with different reverse mechanism would be more potent than using modulators of the same reverse mechanism.【Key word】Kidney neoplasmsCa

6、rcinomaDrug tolerance近10年來對腫瘤的耐藥機制和各種逆轉劑分別進行了大量的研究1，2。雖然在細胞株和動物模型上取得良好逆轉效果，但在臨床實驗中都未獲理想療效。本實驗用四種不同類型逆轉劑，并采用不同組合方案，以探索一種理想的逆轉方案。材料與方法一、材料腎癌細胞株GRC-1來自北京醫科大學泌尿外科研究所，RPMI1640培養液為美國GIBCO產品，SLT spectra酶標儀、CO2培養箱、96孔培養板均為美國產品，觀察用日本Olympus倒置顯微鏡。阿霉素(ADM，上海聯誼制藥廠)；3-4，5甲基-2-噻唑基-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)、異博定(VPM)、Buthi

7、onine sulfoximine(BSO)均為美國Sigma公司產品；環孢素A(CsA，瑞士Sandoz)；三苯氧胺(Tamoxifen,北京醫科大學實驗藥廠)；二甲基亞砜(DMSO，北京化學試劑廠)。二、實驗方法96孔培養板，每孔接種1×104細胞(0.1ml)，BSO實驗組同時加入BSO。5% CO2，37培養14小時后單用組分別加入異博定(10mol/ml)、BSO(200mol/ml)、三苯氧胺(10mol/ml)、環孢素A(10mol/ml)。多藥組合組分別加入異博定+BSO；異博定+BSO+三苯氧胺；異博定+環孢素A；環孢素A+BSO。各藥濃度同單用組。對照組加入等體積

8、RPMI 1640。再培養10小時后，每孔加入10g/ml阿霉素0.1ml，對照組加入等體積RPMI 1640培養液。培養48小時后，吸出培養液，然后以MTT法檢測細胞生存率3三、統計學分析檢測結果做q檢驗。結果單用阿霉素細胞生長抑制率為(16.7±2.8)%，阿霉素、異博定聯用為(34.0±2.6)%，阿霉素、BSO聯用為(21.5±0.4)%，阿霉素、三苯氧胺聯用為(25.6±3.5)%，阿霉素、環孢素A聯用為(22.9±2.7)%。異博定的逆轉效果明顯強于其它三藥(P0.05)，BSO、三苯氧胺、環孢素A三藥的逆轉效果差異無顯著性(P0.

9、10)。四種逆轉劑相互組合與阿霉素合用，單用阿霉素細胞生長抑制率為(16.7±2.8)%，阿霉素、異博定、BSO聯用為(48.5±0.4)%，阿霉素、異博定、BSO、三苯氧胺聯用為(50.8±1.9)%，阿霉素、異博定、環孢霉素A聯用為(32.9±3.2)%，阿霉素、環孢霉素A、BSO聯用為(24.9±3.3)%。以異博定、BSO、三苯氧胺聯用的逆轉效果優于其它方案(P0.05)。討論多藥耐藥現象(MDR)主要由多藥耐藥基因(MDRI)編碼、相對分子質量為170 000的穿膜糖蛋白(P-170 glycoprotein、P-170、P-gp)所

10、引起，P-170被認為是一耗能的“藥物外排泵”，能迅速地將細胞內的藥物排出，使化療藥物不能發揮其作用，從而導致MDR4。Tsuruo等2首先報道異博定可逆轉MDR后，許多藥物被相繼報道具有逆轉作用5，它們主要是鈣通道阻滯劑(VPM等)、環孢素類、激素類(Tamoxifen等)以及其它藥物。這些藥物都是P-170的作用底物，競爭性地與P-170結合而抑制化療藥物與P-170的結合，抑制化療藥物的“外排”，從而增加細胞內藥物的聚集，逆轉MDR。文獻報道上述幾類逆轉效果有所不同6-8。本實驗結果表明上述幾類逆轉劑中以異博定逆轉效果最好，其余三類逆轉效果差異無顯著性。MDR現象除由P-170引起外，谷

11、胱甘肽(GSH)和它的相關酶谷胱甘肽過氧化物酶(GP)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)也是原因之一4。GSH在細胞的防御、解毒、運轉、代謝等方面具有重要作用9，GSH可單獨或在GP、GST的催化下與一些自由基、烷化基、外源性生物活性物質等結合，起到解毒作用10。而一些化療藥的自由基、烷化基正是其細胞毒效應基團，被GSH結合后喪失抗癌作用而導致MDR。BSO抑制GSH生物合成的限速酶-谷胺酰半胱氨酸合成酶，從而抑制GSH生物合成，降低細胞內GSH含量11，逆轉MDR。我們選用異博定、BSO這兩種不同作用機制的藥物聯用逆轉MDR，結果顯示逆轉效果優于兩種同為P-170抑制劑的合用。目前對腫瘤多藥耐藥的

12、逆轉研究，在動物模型、體外實驗中取得了理想的效果，但在臨床應用中效果甚微，主要原因有(1)逆轉劑的毒副作用限制其大劑量應用，使血漿藥物難以達到體外逆轉所需濃度。(2)血漿蛋白的影響，與血漿蛋白親和性低的逆轉劑，很容易擴散到細胞發揮生物活性；相反，血漿蛋白親和性高的逆轉劑要在體內達到逆轉濃度，所需劑量較大，毒副作用也大。(3)逆轉劑與化療藥物相互作用，使藥物代謝、清除發生改變，影響療效。(4)有數種耐藥機制參與MDR，而只對一種機制逆轉很難發揮作用。以上幾點在臨床設計逆轉方案時應予重視。本實驗結果顯示，阿霉素與逆轉劑結合應用可逆轉MDR，單種逆轉劑中以異博定逆轉效果最好，兩種逆轉劑聯用以異博定+

13、BSO效果最佳，兩種逆轉劑聯用效果比單劑逆轉效果更好，兩種不同逆轉機制的逆轉劑聯用，較兩種P-170的抑制劑聯用效果更佳。作者單位：任來成（030001 太原，山西醫科大學第二醫院泌尿外科）薛兆英俞莉章（北京醫科大學第一醫院泌尿外科）參考文獻1Pastan I,Gottesman MM.Multiple drug resistance in human cancer.N End J Med,1987,3161388-1397.2Tsuruo T,Iida H,Tsukagoshi S,et al.Increased accumulation of vincristine and adriamy

14、cin in drug resistant P388 tumor cell following incubation with calcium antagonists and calmodulin and calmodulin inhibitors.Cancer Res,1982,424730-4733.3Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and surviral:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immuno Me-thods,1983,655

15、5-63.4Mickisch GH,Roehrich K,Koessig J,et al.Mechanisms and modulation of multidrug resistance in primary human renal cell carcinoma.J Urol,1990,144755-759.5Lum BI,Fisher GA,Brophy NA,et al.Clinical trials of modulation of multidrug resistance.Cancer,1993,723502-3541.6Mickisch GH,Kossig J,Tostado RK

16、,et al.Circumvention of multidrug resistance mediated by P-170 glycoprotein using calcium antagonists in primary human renal cell carcinoma.Urol Int,1991,47118-125.7Warner E,Tobe SW,Andrulis IL,et al.Phase - study of vinblastine and oral cyclosporin A in metastatic renal cell carcinoma.Am J Clin Onc

17、ol,1995,18251-256.8Millward MJ,Lien EA,Robinson A,et al.High-dose (480mg/day) tamoxifen with etoposide:a study of a potential multidrug resistance modulator.Oncology,1994,5179-83.9Mizutani Y,Youshida O.Overcoming tumor necrosis factor- resistance of human renal and ovarian carcinoma cell by combination treatment with buthionine sultoximine and tumor necrosis factor-.Cancer,1994,73730-736.10Arrick BA,Nathan CF.Glutathione metabolism as a determinan