1、轉基因防齒禹生菜葉片轉化體系的優化陳筑瑚，劉建國'，張燕）馬欣榮3,吳家媛'，唐琳二管曉燕'，顧瑜'，白國輝'（1.遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州遵義563000；2.貴陽市口腔醫院，貴州貴陽550002；3.中國科學院成都分院生物研究所，四川成都610041）摘要：目的：優化生菜的基因轉化系統，為下一步防胡用轉基因植物表達載體質粒轉化生菜工作提供實驗基礎。方法：以6種不同的生菜種子為試材，以1/2MS為基礎培養基，經對出芽率比較，苗齡及直接分化培養基的確定以及抗生素敏感性測試，獲得正常再生抗性生菜植株。結果：34d的“意大利”生菜子葉在1/2MS+0.0

2、5mg/LNAA+0.Img/L6-BA培養基上直接分化率最高，生根培養其為1/2MS,抗生索巴龍霉素（Pan）momycin）選擇壓濃度為50mg/Lo結論：成功確立了防格用轉基因植物表達栽體質粒的生菜葉片轉化體系，獲得了較高的轉化頻率。關鍵詞：生菜；葉片；植株再生；融病中圖分類號：S636.2文獻標志碼：A文章編號：1001-4705（2012）0830054）5TheOptimalConditionsofTransgeneticSystemofLettuceAgainstDentalCariesCHENZhu'2,LIUJian-guo*,ZHANGYan',MAXin-

3、rong3,WUJia-yan1,TANGLing*,GUANXiao-yan1,GUYu1,BAIGuo-hui1(1.TheAffiliatedStomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000,China；2.TheStomatologicalHospitalofGuiyang,GuiyangGuizhou550002,China；3.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,ChengduSichuan610041,Cihna)Abstract:Objec

4、tive:Toobtainoptimalconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichcouldprovidetheconditionforthefurthertransformationstudyoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcaries.Method:Byusingthesixdifferentvarietieslettuceasexplants,thetechnologyofplantregenerationwasstudied.Severalfactorssuchasbudratio,

5、hormoneconcentrationandtheantibioticselectionpressureandsoon,wereinvestigatedtooptimizetheregenerationsysteminvitro.Result:Theexperimentalresultsshowedthatcomparedwithsixdifferentvarietiesoflettuce,Theseedof"YiDali"lettucesproutfastestanditsbudratioisthehighest.Itisshownthatthebestoptimalc

6、onditionsisthatthe3-4dayoldlettuceplantcotyledongrewonthe1/2MS+0.05mg/LNAA+0.1mg/L6-BAmedium；Itwasoptionaltochoice50mg/Lparomomycinastheantibioticselectionpressure.Conclusion:Theconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichshouldprovidetotransformationoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcari

7、es,weresuccessfullyconstructed.Keywords：lettuce；leaf；plantregeneration；dentalcaries收稿日期:2012-05-19項目基金：國家自然科學基金資助項目（編號：30160086）；教育部高等學校特色專業建設項目資助（文件號:教高函：200731號）；貴州省高等學校示范性專業建設項目資助（文件號：黔教高發2008J184號）；貴州省高層次人才科研條件特助經費項目（合同號:TZJF-20I1年-30號）。作者簡介:陳筑（1979-）,女，貴州省貴陽市人;博士，主治醫師，研究方向：胡病的免疫學防治;E-mail：16058

8、94600。通訊作者：劉建國，博土，教授，主任醫師;E-mail轉基因植物可食疫苗具有生產成本低、可永久表達外源蛋白質、不用冷藏、町直接食用等優點，有關轉基因植物可食疫苗的研究受到高度的重視，該領域的研究進展非常迅速。植物轉基因的前提條件是建立高效的植株再生系統。生菜極富營養，含有抗氧化物、F胡蘿卜素及維生素B,工2工6、維生索C和維生素E,它還含有豐富的微景元素和膳食纖維素。最新的研究發現，球形生菜中含有一種原兒茶酸物質，對胰腺癌有明顯的抑制作用。另外，常吃生菜能改善胃腸血液循環、有效預防膽石癥和膽囊炎等功效。牛.菜吃法甚多，深受大眾喜愛。轉基因植物工程中,生菜遺傳

9、轉化研究開展較早，有較好的遺傳轉化體系，已成為不錯的生產食用疫苗生物反應器1材料與方法11材料1.1.1生萊材料實驗用生菜為美國大速生、意大利生菜、路路通、意大利抗熱耐抽墨生菜、香港玻璃生菜、臺灣玻璃生菜，購至四川省農科院種子公司。分別命名為S1、S2、S3、S4、S5和S6。1.1.2質粒和菌株轉化用農桿菌為EHA105,分別含植物表達載體質粒p2355-gtfB（攜帶選擇標記基因為抗性基因npt-D基因及報告基因gus）和p2365-gtfB（攜帶選擇標記基因為抗性基因npt-D基因）（本課題組前期構建）。12方法1.2.1不同生菜種子出苗率比較生菜種子（S1、S2、S3、S4、S5和S6

10、）用3%4%次氯酸鈉水溶液振蕩滅菌15min后，以無菌水清洗3次，播種于1/2MS培養基上，每個三角瓶15粒，光照16h/d,25X.條件F誘導發芽。14d后統計各生菜種子的出苗率，選擇發苗率最高的一種生菜苗進行下一步實驗。1.2.2苗齡及直接分化培養基的確定取苗齡為34d、710d的生菜子葉橫向切片去除端部，每葉24片，置于FlF8培養基E,每皿10個。25丁，16h/d光周期條件下誘導不定芽形成。1個月后統計不定芽發生的外植體頻率。1.2.3 抗生素敏感性測試根據離體培養結果，篩選出適宜的選擇再生培養基F1及34dS2生菜子葉，用F1附加抗生素進行抗生素敏感性測試。將S2外植體置于附加（0

11、、10、15、25、5O、75、1OOmg/L）的卡那霉素F1培養基上。另取一部分子葉接種于附加（。、25、50.75mg/L）的巴龍霉素F1培養基上，分別進行卡那霉素、巴龍霉素的敏感性測定，培養條件同上，定期記錄分化情況。1.2.4 菌株培養將-70勾保存的含有植物表達載體的根癌農桿菌陽種EHA105接種于3mL含Km（100陌mL）和利福平（100妃mL）的I.B液體培養基中,28X.200r/min振蕩培養過夜，使0D處值為0.60.8。按1%2%的比例轉入新配制的無抗生素的1/2MS液體培養基中，同時加入100mol/L的AS。在與上相同的培舞條件卜培養6h左右,01）如值約為0.5時

12、即可。1.2.5轉化及篩選于無菌操作臺將34d苗齡的生菜子葉,放入浸染液中浸染15min后取出，葉背向下置于共培養基中,25Y暗光培養2d后,將切片轉入分化培養基中，25Y培養，每皿10個外植體,14d繼代1次。1.2.6生根及移載將長出的不定芽轉入加巴龍霉素50mg/L,特美汀100mg/L的1/2MS培養基中誘導生根。生根后開瓶鍛煉，移入土中。2結果2.1生菜發芽率的比較實驗比較（S1、S2、S3、S4、S5和S6）6種生菜材料,意大利生菜（S2）種子在1/2MS培養基上發芽最快、出芽率最高,差異有統汁學意義（p<0.05）（見表1）。表1生菜發芽率的比較品種編號成熟種子出芽數出芽（

13、%）美國大速生S11005353意大利生菜S21008383路路通S31007070意大利抗熱耐抽苔生菜S41005757否港玻璃生菜S51006565臺灣玻璃生菜S6100676710.0500.1347-105050增長再生最好增K再生較好403020.050.23-450大部分褐化177-1050無再生芽030.100.13450大部分禍化)97-1050大部分福化340.!0.23450無再生芽071050無再生芽0500.50.053-450無再生芽071050無再生芽060.50.13-450無何生芽071050無再生芽0701.00.053-450生長緩慢2571050無再生芽0

14、81.00.13450生長緩慢1771050無再生芽010.0500.1347-105050增長再生最好增K再生較好403020.050.23-450大部分褐化177-1050無再生芽030.100.13450大部分禍化)97-1050大部分福化340.!0.23450無再生芽071050無再生芽0500.50.053-450無再生芽071050無再生芽060.50.13-450無何生芽071050無再生芽0701.00.053-450生長緩慢2571050無再生芽081.00.13450生長緩慢1771050無再生芽0激素水苗齡外植體數應止牯冷直接分化率NAAIAA6-BA（d）（個）珈（%

15、）不同激素濃度對不同苗齡生菜葉片外植體芽分化的影響2.2苗齡及直接分化培養基的確定在1/2MS培葬基中加入不同的激素.配制成多種培養基，對苗齡為34d、710d的生菜子葉葉片進行研究，篩選分化效果好的培養基。不同濃度組合對生菜再生影響結果見表2。S2生菜子葉接種57d后，各培養基中絕大部分生菜子葉邊緣或基端切口處開始有愈傷產生JOd左右，在部分培養基中愈傷組織大代增生，部分培養基中愈傷組織不繼續再生而分化出綠芽,通過對不同苗齡的生菜在兒種不同培養基中分化情況的統計，發現34d的S2生菜子葉在F1培芥基中培養710d后,部分子葉從切口直接形成綠色小芽,宜接分化率為40%。其余培養基直接分化率較低

16、，且外植體在7d后容易出現褐化死亡。2.3抗生素敏感性洲試生菜在對卡那毒素及巴龍得素的敏感性魂I定中發現,在使用Km時生菜白化苗現象較高，而用巴龍霉素沒有發現白化茴.確定選擇50mg/L巴龍霉素作為抗生素進行轉基因生菜的篩選。2.3.1卡那霉素敏感性測定表3Km敏感性實驗Km濃度（mj/L）01015255075100外植體數(塊)50505050505050代接分化率(%)401062000生根及植株情況好較好少數出現白化苗生長緩慢無無無A：4dA右生菜外植體在分化培養米上周圍少量愈傷生成;B：714d生菜外植體愈傷姐熾芽分化;C：4抗徑生菜在生根培養房中長根；D：檢證攜0的獲因的轉基因生菜

17、移枝至土墳中栽培圖1生菜轉化將苗齡為34d的生菜子葉置于附加不同濃度Km的F1培養基上，可見Km為0時愈傷組織正常產生并分化或直接從切口處出芽、生根，植株正常生長;附加Km后所有培養的子葉均無愈傷組織產生，含10、15.25mg/LKm的培養基中少數子葉產生生長緩慢并逐漸白化的小芽或直接產生白化芽、芽分化及根生長率明顯降低。子葉及植株在含50mg/L以上的Km分化培養基中黃化逐漸死亡。統計結果分析顯示，50mg/LKm作為選擇壓力較好(見表3)。2.3.2巴龍霉素敏感性測定將34d的生菜子葉置于附加不同濃度巴龍篝素的F1培養基上，可見巴龍霉素為0時愈傷組織正常產生并分化或直接從切口處出芽，生根

18、及植株并正常生長;附加巴龍霉素后所有培養的子葉均無愈傷組織產生，含10、15、25mg/L巴龍霉素的培養基中，芽分化及根生長率明顯降低。子葉及植株在含50mg/L以上的巴龍霉素分化培養基中黃化逐漸死亡。50mg/L巴龍霉素作為選擇壓力較好(見表4)°表4巴龍霉素敏感性實驗巴龍濃度(mg/L)01015255075100外植體數(塊)50505050505050真接分化率(%)401351000生根及植株情況好較好緩慢生長緩慢生長無無無2.4轉基因生菜抗性植株的獲得通過農桿菌介導的葉盤法分別將植物表達質粒p2355-gtfB、p2365-gtfB轉化生菜。浸染的生菜子葉葉盤在誘芽篩選培

19、養基(MS+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+50mg/L巴龍+100mg/LTim)培養14d左右即可誘導出芽,將長至11.5cm的芽切下，插入1/2MS+50mg/L巴龍+100mg/LTim的生根培養基誘導生根，生根者為抗性植株，轉移至土壤種植。本實驗共得到抗性生菜129株,攜帶表達質粒P2355-gtfB75株,攜帶表達質粒p2365-gtffi64株，經觀察攜帶P2365-gtfB的生菜植株普遍比攜帶p2355-gtfB健壯(見圖1)。3討論3.1植物受體的選擇目前,轉基因植物疫苗的研究報道主要集中在煙草、馬鈴薯、擬南芥等模式植物上，如在煙草中表達鏈球圜屬突變株表面蛋白

20、、乙肝表面抗原、大腸桿菌熱敏腸毒素B亞基表面蛋白、人類細胞巨化病毒表面蛋白，在馬鈴薯中表達霍亂病毒表面蛋白、諾沃克病毒表面蛋白和細菌性腹瀉抗原，以及用擬南芥生產口蹄疫抗原等，但這些植物都不適合生產可食用的口服疫苗。生菜為菊科茵苣屆植物,是一種由國外引進的生食蔬菜,具有較高的營養價值，生長周期短，整株可以生食,再生和轉化率較高，是一種用來表達外源蛋白的良好宿主植物。因此，本實驗選用生菜作為轉化受體植物，期望得到可生食的轉基因生菜植株，為后續的動物實驗和一系列免疫實驗研究提供依據C3.2生菜的高頻率再生系統3.2.1 外植體的選擇外植體的選擇是建立再生系統的第一環節。作為轉基因植物外植體材料已經研

21、究得非常廣泛，涉及到植物的各個組織、器官和部位，不同外植體的脫分化和再生能力、細胞全能性潛在趨勢及感受態程度等都有很大差異。本實驗通過對不同生菜子葉為外植體建立離體培養再生系統的過程中發現，不同品種的生菜外植體之間的分化能力差別很大，在6個品種中，意大利生菜子葉具有增殖及再生能力強,且穩定性好的特點。已有學者報道，以生菜子葉為外植體的成功轉化能誘導宿主產生相應的抗體SE。本實驗通過對34d、710d的意大利生菜子葉的直接分化率比較發現，34d的生菜子葉獲得的不定芽明顯高于710d的生菜子葉。3.2.2 直接分化培養基的確定設計出適宜的培養基是建立好的再生系統的一項重要工作，也是進行基因轉化研究

22、的先決條件。直接分化再生系統具有操作簡單、方便、獲得植株周期短、能較好保持植物穩定性、實現穩定遺傳的優點。劉凡等研究表明，生菜大湖366以采用MS+(0.5mg/L)6-BA+0.1mg/LNAA的誘芽培養基為宜;趙吉強等對生菜的研究認為.MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)NAA的誘芽培養基對芽的誘導率最高。而左曉峰質選用MS+(0.1mg/L)6-BA+(1.0mg/L)IAA誘導培養基獲得了轉基因生菜。本實驗通過對NAAJAA分別與6-BA的不同激素的組合獲得了芽的分化，得到了再生植株，結果表明，誘芽培養基以1/2MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)N

23、AA獲得的不定芽分化率最高。3.2.3抗生素的選擇植物基因轉化中最廣泛應用的選擇標記是新霉素磷酸轉移酶基因(nptU)，它編碼的產物對某些氨基葡糖昔類抗生素如抗巴龍霉素、G418、新霉素、卡那霉素等反應敏感。如果抗生素對植物細胞毒性太大，在短期內很快殺死植物細胞，造成轉化細胞難以存活，因此選擇既能有效地抑制非轉化細胞的生長，又不影響轉化細胞正常生長的抗生索及其濃度至關重要。本實驗早期我們選用卡那霉素作為選擇劑，發現選擇壓力在50mg/LKm時不定芽在生長過程中逐漸變為白化苗,沒能獲得轉基因苗。后來改用濃度為50mg/L的巴龍霉素篩選,獲得的抗性植株經驗證大多數為含目的基因的轉基因材料，效果極佳

24、。3.3關于選擇標記基因對轉基因植株的影響在基因轉化過程中，當篩選到轉基因植株后，標記基因的存在不僅影響目的基因的穩定，而LL會加重植物細胞代謝的負擔。此外，標記基因的安全性問題也是值得考慮的問題：“皿，所以去除標記基因有利于外源基因的穩定表達。本實驗構建了攜帶。-葡萄糖昔酸酶基因(gusA)的植物表達質粒p2355-gtfB和在其基礎上去掉gusA基因的植物表達質粒P2365-gtlB,通過對轉基因生菜的觀察發現不含gusA基因的轉基因生菜普遍生長較含gusA基因的轉基因生菜健壯，旦部分GUS染色陰性的生菜植株也能擴增出gtfB部分目的片段，提示標記基因的存在可能對轉基因生菜的生長及表達特性

25、有影響，標記基因對轉基因生菜中GTF-1的表達及對轉基因生菜的遺傳穩定性和安全性的影響有待進一步研究。參考文獻：1GiddingsG,AllisonG,BrooksD,etal.TransgenicplantsasfactoriesforbiopharmacculicalsJ.NatBiotechnol,2000,18(11):1151-1155.i2KanagarajAndersonPaul,VermaDheeraj,DaniellHenry.Expressionofdengue-3premembraneandenvelopepolyproteininlettucechloroplasts.

26、PLANTMOLECULABBIOIXJGY,2011,76(3-5):323-333.3MarcondesJackson,HansenEkkehard.TransgeniclettuceSeedlingsCarrjingHepatitisBVirusAntigenHbsAg.BRA-(上接第4頁)參考文獻：1李立會,李秀全.楊欣明.小麥種質資源描述規范和數據標準M.北京：中國農業出版社,2000：50-60.2矣金華，吉萬全,李鳳珍.黑麥在小麥改良中的應用研究進展.麥類作物學報2005,25(1):115-119.；3YangZJ,LiGR,JiangHK,ergenomic

27、interactionofNucleolus,gliadinanddiseaseresistanceinaTriticurnAcsli-vuni-SccaleAfricanumamphiploidfJ.JournalofSichuanAgri-cuhureCniversity,2(X)1,19(4)：34O-343.'4KorzunV,Malyshev8,VoylokovAV,etal.Ageneticmapofrye(SecalecerealeL.combiningRELP,isozyme,protein,mic-njsatelliteandgeneloci：J!,ITieorApp

28、iGenet,2001(102):709-717.5物向暉，吳穎欣，林順權.6種枇杷屬植物花粉形態掃描電鏡觀察J.果樹學報.2009.26(4):572-576.ZILIANJOURNALOFINFECTIOUSDISEASES,2008,12(6)：469-471.k4HuyNguyen-Xuan,KimYoungSook.JunSang-Chel,etal.ProductionofaHeat-labileEnterotoxinBSubunit-porcineEpidemicDiarrheaVirus-neutralizingEpitopeFusionProteininTransgenicLettuce(Laclucasativa).BIOTECHNOLOGYANDBIOPROCESSENGINEERING,2009,24(6)：731-737.5唐琳，劉建國，馬欣榮.兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價J.種子,2008；27(9)：17-186PniewskiTomasz,KapustaJozef,BociagPiolr,etal.Low-doseoralimmunizationwithlyophilizedtissueofherbicide-resistantlettuceexpressinghepatitisBsurfaceantigenforpro