1、間接法 ELISA SOP一、包被1抗原包被量為20g/板。2例如：抗原濃度為0.8mg/ml 。3取 25l 抗原與 20mlCBS （抗原包被液）混勻，100 l/孔。4包被完畢后，4過夜。二、封閉1從 4冰箱中取出酶標板，甩干包被液，拍板。2加封閉液，200 l/孔。3 37孵育 2h。4甩干，洗板（3 次）。5用干燥的自封袋4保存?！咀ⅰ浚合窗澹瑢⒖變纫后w甩出，每孔加 200l -300 l洗板液，靜置 2min ，甩出，將板拍在干的紗布上，將孔內液體拍干為佳。三、一抗1可洗板一次。2陽性對照：1l 陽性血清加入1ml 抗原稀釋液中，做1： 1000 稀釋（第一孔） 。3陰性對照：做1

2、： 2 萬稀釋。用 1l 陰性血清加入100 l 抗原稀釋液中，先做1： 100稀釋。再從此液取出 5l 加入 995 l 的抗原稀釋液中，最終稀釋為1：2萬。4空白對照：只加抗原稀釋液。5除第一孔和陰性對照孔外，每孔加100 l 抗原稀釋液。6第一孔加 100 l（ 1： 1000）的陽性對照。7第二孔加 100 l（1： 1000）的陽性對照，吹打混勻，再從二號孔中吸取100 l 加到 3 號孔中，做倍比稀釋，最后兩孔為陰性對照或空白對照。1： 10001： 20001： 40001： 80001： 160001： 32000陰性對照（ 1：2 萬）空白對照8將酶標板37孵育 1h，洗板

3、3 次?！咀ⅰ浚和ǔＴ诘谝淮巫鯡lisa 時，應該做陰性對照的梯度稀釋，從中選擇最佳的稀釋倍數( 一般認為吸光值小于0.1 的陰性稀釋倍數為易)。更為嚴格的操作是，陽性，陰性，空白的對照空均為雙復孔或三復孔。在稀釋一抗，或者二抗的時候，要算好每次的用量。四、二抗本次檢測采用二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG1用 0.01MPBS 做 1： 5000 稀釋（現用現配） 。2 100 l/ 孔。3酶標板37孵育 30min,洗板 3 次?！咀ⅰ浚翰捎玫亩沟乃沟奈锓N應當與一抗的來源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗就應該選擇羊抗兔或者是其他種屬抗兔的酶標二抗。五、顯色1顯色液參照底物配制表。

4、總體積(ml)108642A+B混合液 (ml)108642TMB(ml)0.50.40.30.20.10.75%H2O2 ( l)3225.619.212.86.42 100 l/ 孔。3酶標板37孵育 15min ，不洗板，直接加終止液。【注】：最后顯色陽性、陰性、空白都沒有一點顏色，很有可能是二抗或者顯色劑出了問題。其次還有可能是包被或封閉出了問題， 那最后只能是一抗不能和抗原結合了 （可能性較小）。最后顯色陽性、陰性、空白都有顏色，可能是， （ 1）陽性的顯色結果是非特異結合；（ 2）陰性稀釋不夠，或者本身陰性血清就含有可以和抗原結合的物質（動物的個體差異造成） ；（ 3）洗板沒洗干凈

5、，可以增加洗板次數和時間，提高洗板效果。出現“跳孔”即，抗體的吸光值并不是根據稀釋梯度逐級遞減，可能是在做梯度稀釋的時候出現了失誤（一般新手的較易出現這種情況）。六、終止終止液為 2M 的 H 2SO4。100 l/孔，終止后立即用酶標儀檢測，波長為450nm 下記錄實驗結果。分析抗體效價。如，稀釋倍數抗體1:5003.1381:10002.9571:20002.3511:40001.6441:80001.0471:160000.611陰性 1：2 萬0.096空白0.094【注】：我們把抗體的吸光值大于1 的稀釋倍數，認定為有效加的。最接近1 的那個稀釋倍數為該抗體的效價。如本圖，該抗體的效

6、價為1:16000 。我們的認定方法和教科書上規定的方法不同，但是教科書上的方法過于理想化，根據普遍的各個實驗室的實際經驗來看，我們才采用了上述方法來判定抗體的效價。附錄 1 ELISA 液配方包被液【 10× CBS】（pH9.6 ）配制量1L配制方法1.稱量下列試劑，置于1L 燒杯中。Na2CO315.9g150mMNaHCO 329.3g350mM2.調節 pH 值至 9.6， dH 2O 定容至 1L 。3.4保存?？乖浚?200ng/孔， 20ug/板。一抗稀釋液（封閉液） 配制量100ml配制方法1.稱量下列試劑。牛血清白蛋白（ BSA ）1g吐溫 -200.05ml0

7、.1M PBS10ml2.dH2O 定容至 100ml。3.注：吐溫較為粘稠，用槍吸取時要多停留一會兒。4.4保存。二抗稀釋液【 0.01MPBS 】0.1MPBS(PH=7.2)配制量1L配制方法1.稱量下列試劑。NaH 2PO4·2H2O2.83gNa 2HPO4·12H 2O28.98gNaCl85g2.調節 pH 值至 7.2， dH2O 定容至 1L。3.常溫保存。顯色液A+B 混合液配制量50ml配制方法1.稱量下列試劑。檸檬酸 (A)0.47gNa 2HPO4·12H 2O(B)0.73g2.dH2O 定容至 50ml。3.4保存。TMB 【四甲基聯

8、苯胺 】 配制量10ml配制方法1.稱量下列試劑。TMB20mg無水乙醇10ml2.4保存。0.75%H2O配制量400l2配制方法10l 30%H O +390l dHO222注：顯色液混合時，現用現混。0.75%H 2O2 現用現配。終止液【 2M 濃 H 2SO4】 配制量1L配制方法1.110ml 濃 H2SO4+890ml dH 2O2.常溫保存。10×洗板液配制量1L配制方法1L 0.1M PBS+5ml吐溫 -20附錄 2 試劑及儀器廠家酶標板（ 96 孔）Corning酶標儀的Thermo辣根過氧化物酶標記的羊抗兔中杉金橋附錄 3 ELISA 的基本原理ELISA的基

9、礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體， 也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。 加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度

10、。原理就是用已知的抗原包被酶標板，經過封閉后， 加入待檢抗體， 再加入抗待檢抗體的抗體（抗抗體，即二抗，例如，抗兔免疫球蛋白IgG 抗體），這個二抗是商品化的，是用一抗做抗原免疫實驗動物而制得的，試劑公司都有賣的，往往用堿性磷酸酶（AP ）或辣根過氧化物酶 （HRP）標記，實驗的結果在最后加入該標記酶的底物溶液后通過顯色來判斷陰性或陽性。抗體結合抗原的位點是Fab 端，待檢IgG 的 Fab 端就和已知的包被抗原結合，Fc端游離，加入的二抗就通過其Fab 端與 IgG 的 Fc 端結合。分子式CH4N2O 分子量 60.06分子式H2O2 ， 分子量 34.01分子式 CO(NH2)2

11、3; H2O2分子量 .47% 過氧化尿溶液樣品名稱及稀釋倍數過氧化尿素加入量OD值1： 10003.2ul1.8431： 10006.4ul1.9601： 100012.8ul1.796兔-anti-G1： 100019.2ul1.8041： 100025.6ul1.6911： 100032ul1.6871： 100038.4ul1.603空白對照38.4ul0.093ELISA 顯色系統配制試驗顯色A液總體積 (ml)5顯色緩沖液 (ml)4.5TMB(ml)0.5顯色B液總體積 (ml)5顯色緩沖液 (ml)51.175%過氧化脲32( l)此顯色溶液放于4°冰箱中可長期使用。顯色液顯色緩沖液（ A+B 混合液）配制量50ml