1、雞新城疫疫苗的研究進(jìn)展恩ii曼圖胡謝文強(qiáng)2(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué).內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)象古金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010030)新城疫(ND),又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟等。是由新城疫病毒(NDV)引起的主要感染雞、鴿、約鶉、火雞等家禽和野生禽類的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。可感染50個(gè)鳥目中27個(gè)目240種以上的禽類，世界各國(guó)都十分重視該病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0IE)將其列為動(dòng)物法定必報(bào)傳染病。ND不但給禽類帶來災(zāi)難性損失，而旦還嚴(yán)重影響禽及禽類制品的國(guó)際貿(mào)易。因此，世界各國(guó)對(duì)該病的發(fā)生流行都采取極為嚴(yán)格的防控措施。目前，普遍采用ND的活疫苗和油乳劑滅活疫苗進(jìn)行

2、預(yù)防免疫，并在很大程度上控制了該病的大規(guī)模流行。很多國(guó)家在本國(guó)內(nèi)禽類的防控政策上，也分別采取了不同的措施及防控戰(zhàn)略。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，一般不再使用疫苗免疫，或僅僅少量使用滅活疫苗，或者使用低毒活疫苗以及基因工程疫苗，在局部地區(qū)使用。發(fā)展中國(guó)家還是使用疫苗免疫的防控策略。目前已經(jīng)使用的有新城疫疫苗有弱荏凍干活疫苗、油乳劑滅活疫苗、基因工程苗等。雞新城疫科毒疫苗是用NDV低毒株接種敏感雞胚培養(yǎng)獲得病毒抗原經(jīng)一系列檢測(cè)和配制而成的凍干疫苗。接種后疫苗毒能在體內(nèi)繁殖，并刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫以及細(xì)胞免疫，還有非特異性的局部黏膜免疫反應(yīng)。1999年，Bensink等從澳大利亞45株無養(yǎng)株中選出12個(gè)荏

3、株，將對(duì)這些毒株進(jìn)行熱穩(wěn)定性人工選擇，將增強(qiáng)的穩(wěn)定性毒株直接接種小鳴并用這些株的疫苗進(jìn)行免疫，接種的小雞產(chǎn)生很高的抗體滴度。2000年，Blignant等人用LaSota低毒力弱毒疫苗皮下接種免疫鴿子，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試騎(ELISA)方法檢測(cè)到特異性抗體，證明該方法免疫能夠引起良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同年，F(xiàn)oster等人在坦桑尼亞某個(gè)地區(qū)分離到的NDV熱穩(wěn)定性毒株V4,采用通過點(diǎn)眼和飲水免疫途徑,獲得免疫雞抵抗強(qiáng)度攻擊的保護(hù)力。而且飲水免疫方法達(dá)到了70%的保護(hù)率。將野外分離毒株將進(jìn)行熱穩(wěn)定性選育，可以人工方法得到熱穩(wěn)定性毒株，達(dá)到提高血凝素的目的。如新城疫LaSota毒株以及B1毒株。在中國(guó)

4、免疫預(yù)防接種的新城疫弱毒疫苗有兩種類型，其一是中等毒力的I系疫苗(Mukteswar株),其二是弱毒的n系(LaSota株)、W系和V4系等弱毒疫苗。2000年，金擴(kuò)世等對(duì)新城疫新分離的長(zhǎng)春株-NDV-CC株進(jìn)行分析研究，已證明該株是個(gè)弱毒株，將該毒株制備的疫苗免疫7日齡雛雞，14d后用新城疫強(qiáng)春攻屋，效力檢驗(yàn)結(jié)果是免疫雞保護(hù)率為100%,可以完全抵抗強(qiáng)毒攻擊。2001年,郝勤宗等用NDV疫苗毒株和熱穩(wěn)定性天然弱毒株B95,經(jīng)不同途徑接種免疫雞都產(chǎn)生r很好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。滅活疫苗是用物理或化學(xué)方法滅活病旌獲得疫苗抗原，井用佐劑乳化成的疫苗。因使用了已滅活的抗原，所以安全性好，免疫應(yīng)激反應(yīng)小等優(yōu)

5、點(diǎn)。上個(gè)世紀(jì)70年代以后，用富氧化鋁作為佐劑,制造了新城疫滅活疫苗。后來的凡年內(nèi).在歐洲應(yīng)用比較廣泛。然而，富氧化鋁膠苗的免疫保護(hù)力差，沒使用幾年就被弱毒活疫苗所取代了。后來退速發(fā)展起來了油乳劑滅活疫苗，因免疫保護(hù)率好，免疫副反應(yīng)小等特點(diǎn)，直到目前仍然披當(dāng)做重要的免疫預(yù)防疫苗。1995年，Takada等經(jīng)鼻腔免疫接種雞新城疫滅活疫苗，免疫雞獲得了的局部以及全身的抗體反應(yīng)，對(duì)免疫雞用NDV致死量的強(qiáng)毒經(jīng)鼻腔內(nèi)接種攻毒，接種雞產(chǎn)生了抵抗強(qiáng)毒的免疫力。2001年，沈志強(qiáng)等用新城疫Clone-30毒株接種非免疫雞胚，獲得制苗抗原液，用甲醛天活，抗原液與天然免疫增強(qiáng)劑蜂膠純化后混合進(jìn)行乳化，研制成雞新城

6、疫蜂膠滅活疫苗。該疫苗安全性和效價(jià)良好。張曉根等研制了雞新城疫蹈毒株和新城疫地方分離株HDK該毒株是在中國(guó)河南省鶴壁分離到的地方分離株，屬亍基因vn型株)二價(jià)油乳劑滅活苗，其各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)表明，二價(jià)疫苗安全無免疫副反應(yīng)，免疫力好等特點(diǎn)。天活苗的一個(gè)特點(diǎn)是產(chǎn)生免疫力時(shí)間較弱毒活疫苗長(zhǎng)，不能單一地免疫預(yù)防雛雞，因?yàn)殡r雞必須盡快獲得免疫保護(hù)力。因此為了使盡快獲得免疫力，雛雞的首免應(yīng)該同時(shí)接種弱毒疫苗和滅活疫苗。當(dāng)前，滅活疫苗都采用油佐劑，目前預(yù)防雞新城疫使用的大部分是油乳劑滅活疫苗。2005年，楊百亮等試驗(yàn)證明，油乳削滅活疫苗接種的雞血清HI抗體滴度很快上升，抗體滴度在達(dá)到高峰后能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持較高的

7、水平，該疫苗可用于常規(guī)的免疫預(yù)防。為了減少對(duì)雞的免疫次數(shù)和應(yīng)激反應(yīng)，世界上很多國(guó)家都采用聯(lián)苗的方式接種預(yù)防雞的各種疫病。如在美國(guó)和日本比較普遍采用聯(lián)苗。無論滅活疫苗還是活疫苗免疫預(yù)防新城疫，必須制定合理的免疫程序，才能發(fā)揮疫苗最大效力保證抵抗病毒攻擊，雞新城疫弱毒活疫苗以及滅活疫苗的特點(diǎn)比較見表1«無論是活疫苗還是滅活疫苗，由于安全性、穩(wěn)定性和免疫原性等方面都存在一定的不足，當(dāng)前的研究動(dòng)態(tài)是致力于開發(fā)更加安全有效的新型疫苗。基因工程疫苗的種類有亞單位疫苗、重組活載體疫苗、DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗及載體疫苗等。表1雞新城疫活疫苗與滅活疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)比較類別安全，無*力，疫苗穩(wěn)定，-次免

8、疫時(shí)間長(zhǎng)；削:大|需要注射；不產(chǎn)生局部免疫力|火估歿苗可制聯(lián)苗.免疫應(yīng)急反應(yīng)小.抗原使用量大，疫苗成本高。部建匕修；尊自號(hào)登疫苗不穩(wěn)也毒力返強(qiáng)，不安全，可活疫苗管接種可產(chǎn)生局部及全身抗體，可清除能污染病毒，生物安全隱患，需冷藏.野毒.優(yōu)點(diǎn)亞單.位苗是將NDV保護(hù)性抗原基因在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)，用獲得的活性抗原制備的疫苗。亞單位苗的特點(diǎn)是安全性高.穩(wěn)定性好。表達(dá)ND有效抗原蛋白的主要工具是桿狀病毒載體系統(tǒng)。昆蟲桿狀病毒被成為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細(xì)胞被成為受體的表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的特點(diǎn)是表達(dá)含量商.表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻洋之后，容易加匚等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，基因工程方法獲得的新的NDV強(qiáng)隹在免疫雞的體內(nèi)

9、不可能復(fù)制，這種疫苗免疫的雞可用簡(jiǎn)便的血清學(xué)方法來鑒別疫苗接種免疫雞及自然感染NDV的雞。這在臨床上有非常重要的使用價(jià)值。1990年，Nagy等人將新城疫的HN基因插入到桿狀病毒載體中，培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞獲得表達(dá)的菌組蛋白H,該蛋白具有IIA以及NA的活性，能與NDV血清或者HN蛋白的單抗產(chǎn)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。昆蟲細(xì)胞的表面能吸附紅細(xì)胞，將改組HN桿狀病毒以及表達(dá)的HN蛋白配制成油乳劑滅活疫苗免疫雞群后，該表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)的抗體滴度要高于NDV全病毒粒子滅活疫苗。而且重組活疫苗和滅活疫苗免疫接種的雞都能獲得免疫力，可抵抗新城疫強(qiáng)毒攻擊。1994年，Kamiya等證實(shí)，NDV無毒株F蛋白，是經(jīng)重組桿狀病毒

10、表達(dá)系統(tǒng)獲得的，雖然沒有裂解，但是免疫保護(hù)率低，與同年Mori等的試驗(yàn)結(jié)果相反。將重組桿狀病毒表達(dá)的NDVD26株的F蛋白制作成亞整位疫苗，接種雞產(chǎn)生免疫力，可以受新城疫強(qiáng)毒攻擊。因此認(rèn)為F蛋白表達(dá)物免疫原性還需要進(jìn)一步的深入的研究。2002年，丁壯等應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了新城疫分離株-四平株和長(zhǎng)春株的HN0將配制的疫苗經(jīng)免疫雞后，采用ELISA以及HI方法檢測(cè)到免疫雞的IgG和HI抗體。對(duì)免疫雞用NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8攻毒，四平株能達(dá)到65%保護(hù)率*長(zhǎng)春株達(dá)到了100%的保護(hù)率。2003年，Kapczynski將新城疫病毒處理獲得了無感染力的病毒HN和F蛋白，經(jīng)過免疫接種雞，并且與L

11、aSota活疫苗免疫雞做實(shí)驗(yàn)對(duì)照，HI抗體檢測(cè)和攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，這些病毒亞單.位成分具有非常好的免疫原性，在強(qiáng)隹的攻擊試驗(yàn)中，免疫雞都抵抗強(qiáng)毒的攻擊。2005年，曾黎平等將NDV的強(qiáng)毒株F48E8的NA以及F蛋白基因片斷克隆到表達(dá)載體桿狀病毒受體中，仍然獲得了F蛋白和HN蛋白表達(dá)產(chǎn)物而且這些蛋白都是糖基化的。亞單位疫苗具有安全性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于規(guī)模化生產(chǎn)線工藝放大，這種技術(shù)路線是目前新城疫疫苗研究發(fā)展的一個(gè)重要方向。根據(jù)近期文獻(xiàn)報(bào)道，另一種途徑是將利用病誰作為我體構(gòu)建NDV重組病毒。把NDV的F和HN基因在痘苗病健(VV)載體，火雞皰疹病毒(HVT)以及反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)我體中分別獲得

12、度好的表達(dá)。利用痘病毒或是火雞皰疹病毒，以及某些細(xì)藺作為表達(dá)裁體，插入NDV的HN或者F基因。經(jīng)免疫接種試驗(yàn)雞都能技得免疫保護(hù)，可抵抗強(qiáng)毒攻擊。重組活載體疫苗的特點(diǎn)是在疫苗接種后只能產(chǎn)生針對(duì)病毒某些結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，因此在實(shí)際抗體監(jiān):測(cè)當(dāng)中，可以鑒別診斷免疫產(chǎn)生以及自然感染產(chǎn)生的抗體，而且在我體中同時(shí)表達(dá)幾種或多種其它病毒基因。可以做到一次免疫接種預(yù)防多種疾病。插入禽流感病毒HA基因的NDV活載體疫苗預(yù)防雞群，能達(dá)到預(yù)防這兩種疫病的效果。早在1995年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準(zhǔn)并商品化重組雞痘病毒活載體疫苗VectorVAXFP-N。1990年，Edbaucr等用新城疫病毒TexasHN基因構(gòu)建了重組

13、禽痘病毒，用免疫沉淀方法證明了HN蛋白獲得成功表達(dá)。經(jīng)肌肉注射免疫接種重組病毒，免疫雞獲得了抵抗NDV強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力。1990年，Taylor等將新城疫病毒Texas株的F基因插入到禽痘病毒基因當(dāng)中。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)得到了F蛋白，并民經(jīng)糖基化后被切割成F1與F2片段。用取組病毒免疫雞可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng).經(jīng)點(diǎn)眼或口服等途徑免疫重組病毒疫苗，攻毒后已獲得了部分保護(hù)。而通過翅下刺種方法或肌肉注射免疫一次就可達(dá)到100%的攻毒保護(hù)結(jié)果。中國(guó)的研究報(bào)道方面，夏志平等構(gòu)建了重組雞痘病舞，能共同表達(dá)NDV的F基因和傳染性法氏囊病毒(IBDV)VPO基因。通過刺種途徑免疫接種試驗(yàn)雞獲得了良好的免疫應(yīng)答。2003年

14、，韋棟平等構(gòu)建了重組雞痘病毒，共同表達(dá)新城疫病毒F基因以及禽流感病毒H9亞型HA基因。2004年，智海東等構(gòu)建重組雞痘病毒rFPV-gB-F,共同表達(dá)新城疫病毒F基因和傳染性喉氣管炎gB基因，兩種蛋白在雞胚成纖維細(xì)胞得到成功表達(dá)。攻毒結(jié)果是傳染性喉氣管炎攻毒保護(hù)率為70%,新城疫攻毒保護(hù)率為80%。曹殿軍等構(gòu)建了重組雞痘病毒，能表達(dá)HN基因。用該重組病毒按lOFU滴度免疫4周齡SPF雞使80%的攻卷保護(hù)力，如果免疫利量降低到lOPFU,攻毒保護(hù)率減低到60%。2005年，中國(guó)農(nóng)業(yè)部宣布的基因工程疫苗是表達(dá)高致病性禽流感病毒抗原基因的新城疫病毒活載體疫苗，能夠同時(shí)預(yù)防禽流感和新城疫，已經(jīng)使用于兩

15、種疫病的預(yù)防免疫。DNA疫苗又稱基因疫苗，其原理是將編碼異源蛋白基因的質(zhì)粒直接接種動(dòng)物體內(nèi)，并在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生功能性蛋白，而達(dá)到誘發(fā)免疫反應(yīng)目的。新城疫DNA疫苗將NDV的HN或F基因經(jīng)表達(dá)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，借助受體細(xì)胞表達(dá)病毒HN或F蛋白，能誘發(fā)免疫接種動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答發(fā)應(yīng)。1999年，倪振亞等構(gòu)建了重組鼠傷寒沙門氏菌X4550,是攜帶新城疫病毒F48既毒株F基因。經(jīng)7日齡SPF雞免疫兩周后檢測(cè)到了特異性抗體，用致死最強(qiáng)毒攻靛使免疫雞的保護(hù)率達(dá)到了80%水平。2003年，潘志明等將新城疫病毒F蛋白基因克隆到真核表達(dá)載體中，而且轉(zhuǎn)化了減毒的鼠傷寒沙門氏菌中，獲得的重組

16、沙門氏菌可運(yùn)送DNA疫苗。按2xl/CFU免疫劑域免疫小鼠2次后，能檢測(cè)到是針對(duì)F蛋白的特異性血清抗體。試驗(yàn)結(jié)果證明，該運(yùn)送DNA疫苗的減毒沙門氏菌系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)能帽釋放所攜帶的質(zhì)粒，而且能帽刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。陳吉祥等用表面活性劑CATB/DOPE脂質(zhì)體包裹新城疫病毒HN基因，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒PcHNM,經(jīng)免疫5周齡雛雞免1周后，從接種雞血清中檢測(cè)到特異性HI抗體。但是HI抗體水平上，脂質(zhì)體包裹DNA免疫組比較裸DNA免疫組要低些。最后用強(qiáng)毒攻毒后，攻聲保護(hù)率100%的是CTAB脂質(zhì)體DNA免疫組，但是裸DNA攻毒保護(hù)率卻只能達(dá)到81.82%。實(shí)驗(yàn)證明特異性抗體的產(chǎn)生能力提升是由該質(zhì)粒

17、DNA被脂質(zhì)體包裹后引起，井加強(qiáng)了對(duì)強(qiáng)毒的保護(hù)力。趙軍等在HVTFC126株中表達(dá)NDV的Miyadera株的HN基因。張雪蓮等將包含火雞皰疹病毒(IIVT)非必需片段載體PTK2B當(dāng)中，克隆fNDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9的F基因，成功地構(gòu)建了含有F基因表達(dá)核的HVT轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體-PTK3F,為獲得表達(dá)F基因的HVT重組病毒，并在細(xì)胞中進(jìn)一步轉(zhuǎn)染。新城疫病毒抗原編碼基因的帥選、構(gòu)建質(zhì)粒、選擇適合的佐劑等與DNA疫苗的免疫原性直接相關(guān)。另疫苗接種方法途徑等因素的改進(jìn)能使DNA疫苗的效力獲得提高。上述方面的改進(jìn)為研發(fā)安全高效力的DNA疫苗提供新的路線。核酸疫苗(DNA疫苗)與其它疫苗相比，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)

18、便，穩(wěn)定性好，能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效果良好等優(yōu)點(diǎn)。因此目前已成為開發(fā)新型新城疫疫苗的重要技術(shù)路線。轉(zhuǎn)基因植物疫苗是植物內(nèi)導(dǎo)入病原主要保護(hù)性抗原基因而成為轉(zhuǎn)基因植物，借用植物作為表達(dá)載體大筮表達(dá)外源蛋白，獲得免疫原性蛋白制作疫苗免疫動(dòng)物I或者是將轉(zhuǎn)基因植物直接加工按飼料方式入動(dòng)物體內(nèi)能夠獲得免疫力。已經(jīng)報(bào)道有，一種轉(zhuǎn)基因玉米在墨西肝培育成功，玉米的DNA中插入到了新城疫病茬的一個(gè)基因，經(jīng)飼喂這種轉(zhuǎn)基因玉米的雞體內(nèi)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生新城疫血清抗體。YangZQ等成功地將T-DNA重組轉(zhuǎn)入稻米基因組中.該基因含有嵌合的NDV的F基因，經(jīng)ELISA和West-Blot方法分析，已經(jīng)證明表達(dá)了NDV的F蛋白。將這種蛋白免疫試驗(yàn)小鼠能夠產(chǎn)生特異性的抗體反應(yīng)。該類型的疫苗免疫應(yīng)答好，疫苗成本不高，因植物載體而易于保存，使用方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。具有非常好的市場(chǎng)潛力，應(yīng)用前景很廣闊。反向遺傳技術(shù)是指通過反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增病毒的基因組cDNA克隆，在易感宿主體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)再次復(fù)制病毒，在DNA水平上通過基因工程方法和手段修飾病毒的基因組序列。新