1、生物選修3知識點（區(qū)別不同工程和不同操作水平）專題1 ?基因工程概念：按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，通過體外DNA®組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物廣品。基本原理:讓目的基因在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定且高效的表達理論基礎(chǔ):DNA生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，DNA®螺旋結(jié)構(gòu)，遺傳信息傳遞方式核心:構(gòu)建重組DNA分子（一）基本工具（技術(shù)基礎(chǔ)）Cf工具虹具酶1 .限制性核酸內(nèi)切酶（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的（不切割自身DNA勺原因：原核生物中無該限制酶的識別序列或其已被修飾）（2）功能：識別和切割DNg子內(nèi)一小段特殊的脫氧核音酸序列（

2、偶數(shù)堿基對回 文序列）特異性表現(xiàn)：識別特定片段、切割該片段中的特定位點、形成一種末CfGJ GATCC- & J GATC-（3）結(jié)果：DNA>t段末端形成末端堿基互補的黏性末端或平末端用 切割（質(zhì)粒）根據(jù)目的基因的位置或剪輯序列來確定限制酶的種類切割后的片段要畫全2 .DNA連接酶（1）功能：連接具有末端堿基互補的 2個DNNt段，形成重組DN防子Cf DNA聚合酶：只能將單個脫氧核昔酸逐個添加到已有的脫氧核昔酸鏈之后， 需模板DNA連接磷酸二酯鍵3 .載體（1）條件：能在受體細胞中穩(wěn)定保存并大量復(fù)制，基本不影響受體細胞正常生 命活動一至多個限制酶酶切位點（必須在所需標(biāo)記基因外

3、），供外源 DNA 片段插入標(biāo)記基因，便于篩選含有重組 DN防子的受體細胞往往需要根據(jù)需求改造天然載體（2）功能：作為運載工具將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)載體選質(zhì)粒的原因：具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)、能夠攜帶目的基因利用它在受體細胞內(nèi)對目的基因講行大量復(fù)制和轉(zhuǎn)錄/表達（3）質(zhì)粒（最常用的載體）一種能夠自主復(fù)制，在細菌（或酵母菌）中獨立于染色體之外存在的雙鏈環(huán)狀 DNA# 子（4）其它載體：噬菌體、動植物病毒（二）基因工程的基本操作程序第一步：獲取目的基因1 .目的基因：人們所需要的編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2 .方法（1）序列已知化學(xué)合成法 較長DN醺鏈合成過程中容易出現(xiàn)堿基缺失如反轉(zhuǎn)錄法（e.g獲取mRN即轉(zhuǎn)錄成

4、cDNAM用DNA聚合酶生成雙鏈）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增Polymerase Chain Reaction（1）原料：水、緩沖液、4種游離脫氧核昔酸、TaqDN膘合酶、模板DNA（基因）、對基因特異的2段DNA弓I物（防止相互或自身折疊）（2）過程：第一步：加熱至 9095C, DNAg高溫下變性解鏈第二步：冷卻到5560C,引物結(jié)合到互補 DNA® （退火）第三步：加熱至7075C,熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成能量來源于dNTP（2）序列未知建立基因文庫：建立一個包括目的基因在內(nèi)的基因文庫（保存在受體菌中），再從基因文庫中獲取3 .目的基因大量擴增/分子水平的克隆

5、利用受體細胞（如 E.coli ）無性繁殖，利用基因探針釣取，再導(dǎo)入最終受體細胞e.g目的基因f大腸桿菌f農(nóng)桿菌f植物細胞f植物（主要在細菌分裂時幾何級擴增，盡管質(zhì)粒獨立于擬核，可在分裂時發(fā)生自我復(fù)制，但由于多數(shù)細菌對胞內(nèi)質(zhì)粒數(shù)量有限制，故該種復(fù)制對擴增效果不大）PC砒術(shù)第二步：形成重組 DN附子（基因表達載體：啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因）1 .目的：轉(zhuǎn)運目的基因，并使在受體內(nèi)穩(wěn)定存在、 復(fù)制、表達/轉(zhuǎn)錄并穩(wěn)定遺傳（堇因型X0）2 .過程：（1）單酶切：用同種限制酶分別切割目的基因和載體從而形成相同的粘性末端，然后用DNA1接酶將目的基因和載體連接起來有時用不同限制酶也可以形成相同的粘

6、性末端（2）雙酶切：用兩種限制酶切割使目的基因和載體兩端各形成兩種粘性末端，防止載體和目的基因自身環(huán)化第三步：將重組DNg子導(dǎo)入受體細胞需將目的基因整合到動植物細胞的染色體DNA±目的基因是否整合到染色體 DNA±決定于基因表達載體上是否有相關(guān)序列（形成酶）1 .植物體細胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（插入 Ti質(zhì)粒上的T-DNA）,基因槍法、花粉管通道法導(dǎo)入葉綠體DNA中，由于細胞質(zhì)/器DNA勺遺傳與性別相關(guān)聯(lián)，故可避免因花粉傳播而造成基因污染（目的基因傳播到非轉(zhuǎn)基因生物中）2 .動物受精卵：顯微注射技術(shù)用（如顯微注射）技術(shù)/方法將目的基因?qū)?cf轉(zhuǎn)基因/基因工程技術(shù)3 .原核細胞：

7、CaCWCa2+處理法（先用Ca2+#理增加細胞壁通透性， 使之成為感受態(tài)細胞,再將重組質(zhì)粒與感受態(tài)細胞混合，在一定溫度下感受態(tài)細胞吸收DNA分子）原核生物作為受體細胞的原因：繁殖快體積小新陳代謝旺盛（目的產(chǎn)物合成效率高）遺傳物質(zhì)少（便于操作）、單細胞（容易培養(yǎng)）第四步：篩選含有目的基因的受體細胞1 .原因：受體細胞接納重組DNA#子存在概率2 .原理：載體如質(zhì)粒上的抗性基因等標(biāo)記基因3 .方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白：僅以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基菌落表現(xiàn)型：抗不抗第五步：目的基因的檢測和表達目的基因?qū)胧荏w細胞可能僅進行大量擴增，但不一定以此為目的1. DNA核酸分子雜交技術(shù)用cDNA作

8、為探針與從受體細月中提取并解義的DNA/mRN雜交，觀察是否會出 現(xiàn)雜交帶檢測 染色體DNAk是否插入了目的基因 目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA一種基因探針只能檢測水體中的一種病毒；檢測病毒可對照核酸序列放射性同位素標(biāo)記探針基因探針是一小段cDNA可以與相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄出的 mRN骷合（即使被切割）采用DNA分子雜交技術(shù)/方法,用基因探針檢測2 .抗原一抗體雜交：目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)如E.coli合成人胰島素原3 .個體水平的鑒定：如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物（讓害蟲吞食該轉(zhuǎn)基因棉植株的葉片，觀 察害蟲存活情況，以確定其是否具有抗蟲形狀）根本原因： 聯(lián)系基因?qū)用妗f 基因序歹&9基對/脫氧核昔酸

9、序歹（三）基因工程的應(yīng)用1 .動植物基因、細胞工程：優(yōu)點所需時間短克服遠緣雜交不親和的缺陷（對應(yīng)傳統(tǒng)缺點）2 .基因工程藥物：首次是生長素釋放抑制激素，然后胰島素（ E.coli產(chǎn)酶原）、 干擾素等干擾素:我國第一個基因重組新藥。一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是 糖蛋白）,是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。具有抗病毒、抗細胞分 裂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，是治療病毒性肝炎和腫瘤的藥物。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表 面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時還可增強自 然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而

10、起到免疫調(diào)節(jié)作用， 并增強抗病毒能力。3 .基因治療：將正常功能的外源基因?qū)肴毕菁毎麅?nèi)（初級實驗階段、未臨床實 踐）Cf有基因缺陷的染色體/DNA分子上：具體與哪條DNg子結(jié)合 隨機治療隱性遺傳病（正常基因相對缺陷基因呈顯性）4.安全性問題：在導(dǎo)入目的基因的同時可能會導(dǎo)入其他基因如抗生素抗性基因, 可能會使人體內(nèi)細菌抗藥性增強，以致某些藥物的藥效減弱（四）蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基 因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人 類的生產(chǎn)和生活的需求。（基里橫里京則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）If哺霓=糯

11、；1 .克隆clone :無性繁殖系（只由一舉模板分子、母細胞或母體直接形成新一代2 .克隆技術(shù)cloning :從眾多基因或細胞群體中通過無性繁殖和選擇獲得目的基因或特定類型細胞的操作技術(shù)3 .內(nèi)容：（1）分子水平：基因克隆即目的基因的復(fù)制（受體細胞的無性繁殖）、 分離（特定基因探針選擇、釣取目的基因）過程（2）細胞水平：雜交瘤制備單克隆抗體（3）個體水平：不通過兩性細胞的結(jié)合，從一個單一（體）細胞繁殖出生物個體胚胎細胞克隆以胚胎/卵細胞作為供體、利用核移植，不是嚴格意義上的動物個體克隆4 .條件：（1）理論條件：細胞全能性/細胞有發(fā)育成完整個體的全套遺傳物質(zhì)（根本原因）（2）基本條件：具有

12、包含物種完整基因組的細胞核的活細胞具有能有效調(diào)控細胞核發(fā)育的細胞質(zhì)物質(zhì)e.g去核卵細胞完成胚胎發(fā)育的必要的環(huán)境條件 e.g胚胎早期培養(yǎng)環(huán)境/子宮5 .非正面影響：豐富生物多樣性，促進生物進化，維護生態(tài)平衡（二）植物克隆1 .全能性表達的難易程度：受精卵 生殖細胞胚胎/全能干細胞多能（干）細胞專能（干）細胞體細胞； 生殖細胞在一定刺激下染色體可加倍；一些動物存在孤雌生殖植物細胞動物細胞；低等動物高等動物 不同種類植物或同種植物的不同基因型個體間全能性的表達程度大不相同長期培養(yǎng)后的全能性下降原因：染色體畸變、核變異、非整倍體產(chǎn)生；細胞或組織中激素 平衡被打破；細胞對外源生長物質(zhì)的敏感性改變；形成缺

13、乏成胚性的細胞系 植株在多次繼代培養(yǎng)后，會逐漸喪失細胞全能性的表達能力2 .植物組織培養(yǎng)（植物克隆的技術(shù)基礎(chǔ)）（1）理論基礎(chǔ)：植物細胞全能性，即植物體的每個生活細胞都具有遺傳上的全能 性，因而都具有發(fā)育成完整植株的潛能（2）過程:離體植物細胞、組織或器官（外植體）”獲得愈傷組織“誘導(dǎo)形成試管苗“新植株外植體選取形成層（分生組織）部分易于誘導(dǎo)形成愈傷組織A. 培養(yǎng)條件：首先是離體培養(yǎng)（生物體內(nèi)細胞中基因在特定時間和空間條件下選擇性 表達，細胞分化為不同組織、器官，故無法表現(xiàn)出全能性）半/固體培養(yǎng)基（固體為例）a. 營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、蔗糖、維生素、有機添加劑（氨基酸、瓊脂凝固劑等）b. 植物激

14、素/生長調(diào)節(jié)劑（適當(dāng)濃度配比誘導(dǎo)分化出芽/根的頂端分生組織/花）IAA>CTK誘導(dǎo)外植體脫分化形成愈傷組織c. 無菌條件（外植體70%酉精消毒、器械高溫蒸汽滅菌）一一雜菌爭奪產(chǎn)毒d. 適宜的pH溫度和滲透壓B. 光照：若外植體是（帶葉）莖段，不經(jīng)歷脫分化再分化，組培全過程均需要光照；若外植體是非光合作用部位（如胡蘿卜塊根），再分化成芽后光昭 八、C. 試管苗移栽前需煉苗（草炭土 /蛭石，逐漸降濕）D. 愈傷組織：排列疏松的高度液泡化的活的薄壁組織團外植體”愈傷組織“搖床液體懸浮培養(yǎng)分散成單細胞“胚狀體”人工種 子單細胞植物克隆，類似受精卵的卵裂、分化、器官發(fā)生、形態(tài)建 成A .單細胞：細

15、胞質(zhì)豐富、液泡小、細胞核大（胚性細胞特征）酶解細胞壁f原生質(zhì)體培養(yǎng)f新植株（2）用途：微型繁殖、制造人工種子（胚狀體階段）、單倍體育種、作物脫毒（植物分生組織細胞，分裂旺盛病毒極少 Cf抗病毒j、 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鈉溶液，可誘發(fā)和篩選抗鹽植株細胞產(chǎn)物工廠化生產(chǎn) （愈傷組織階段已可，試管培養(yǎng)苗、細胞培養(yǎng) 反應(yīng)器也可）3 .原生質(zhì)體融合/植物體細胞雜交（不同植物）獲得原生質(zhì)體：在甘露醇溶液環(huán)境（ 較高滲透壓）中用纖維素酶和果膠酶混合液處理用網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體到離心管內(nèi)，離心后收集沉淀物，用等滲溶液洗滌；檢驗原生質(zhì)體是否符合要求：依據(jù)滲透作用原理，采用低滲脹破法（見比較表格）4 .植物細胞

16、工程：培養(yǎng)植物細胞（包括原生質(zhì)體），借用基因工程技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入受體細胞或通過細胞融合將不同源的遺傳物質(zhì)重新組合，再通過細胞培養(yǎng)，獲得具有特定性狀的植株Cf細胞工程：細胞培養(yǎng)和細胞融合（若基因型不同為細胞雜交）基因定位：利用細胞雜交中染色體丟失與特定基因產(chǎn)物的對應(yīng)關(guān)系（三）動物細胞工程1.動物細胞培養(yǎng) 指明“動物”細胞培養(yǎng)（1）概念：動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和繁殖。原理：細胞增殖（2）動物細胞培養(yǎng)：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）機械消化或用 胰蛋白酶處理分散成單個細胞（利于細胞與培養(yǎng)液充分接觸，進

17、而吸收氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)并排出廢物）制成細胞懸液”轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶 /卡式瓶中進行原代培養(yǎng)細胞間相互依存，呈現(xiàn)一定程度的組織特性，保持生長分裂、接觸抑制、 衰老死亡貼滿瓶壁的細胞用 胰蛋白酶處理使貼壁細胞從瓶壁上脫落下來并分散成 單個細胞稀釋分裝傳代培養(yǎng)（最初的若干次傳代也歸入原代培養(yǎng)）大多數(shù)細胞最終衰老、凋亡（營養(yǎng)物質(zhì)耗盡遺傳物質(zhì)沒變，衰 老凋亡）動物組織培養(yǎng)：動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性可伴隨組織分化，但主要的生命活動仍以細胞為單位；由于細胞運動 變化，培養(yǎng)物組分發(fā)生變異，長期培養(yǎng)最終成為簡單的細胞培養(yǎng)（3）細胞貼壁和接觸抑制：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼

18、壁。細胞數(shù)目不斷增多，當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互抑制時，細胞就會 停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。（4）動物細胞培養(yǎng)條件（液體培養(yǎng)基）無菌無毒：培養(yǎng)液和用具無菌處理，一定量的抗生素（種、量），定期更 換培養(yǎng)液營養(yǎng)：水無機鹽、葡萄糖、氨基酸、維生素、動物（胎牛）血清、滋養(yǎng)細胞、激素Cf天然（血清）和人工配制成分適宜滲透壓、溫度、pH （ CO培養(yǎng)箱：維持適宜的 pH值7.27.4 ）提高形成率的措施：選擇適宜的培養(yǎng)基和 CO2 pH胰島素等激素刺激 添加血清滋養(yǎng)細胞支持生長（經(jīng)射線照射本身失去增殖力的小鼠成纖維細胞）（5）細胞系：可連續(xù)傳代的細胞（首次傳代細胞即成為細胞系）連續(xù)細胞系

19、e.g異倍體惡性（致癌）/不死性（保留接觸抑制，有限細胞系e.g二倍體細胞傳代培養(yǎng)的原因：細胞密度過大 代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭細胞株：特殊的細胞系（6）細胞克隆/克隆培養(yǎng)法：定義：把一個單細胞從群體中分離出來單獨培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細胞特點：細胞群體來自于同一個細胞（否則具有異質(zhì)性），遺傳性狀均一，表達 性狀相似要求：最基本：分離出來的細胞是一個而非多個一般選擇連續(xù)細胞系：對培養(yǎng)環(huán)境有較大適應(yīng)范圍并具有較強獨立生存能力用途：從普通細胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細胞系2.動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物動物難以克隆的根本原因：細胞分化過程中細胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)蛋白關(guān)閉了核中與個體發(fā)育有關(guān)的基因，使基

20、因選擇性表達，基因組中基因活動不完全（1）原理：動物細胞核的全能性（2）供核細胞：優(yōu)良動物的傳代培養(yǎng) 10代以內(nèi)的細胞后代性別由核供體動物個體的性別決定受體細胞：去核的 MII中期的卵母細胞細胞較大，容易操作細胞質(zhì)營養(yǎng)豐富，具有調(diào)控細胞核發(fā)育、促進核基因表達 的物質(zhì)（3）體細胞核移植的大致過程是：顯微操作去核法多莉羊的成功說明: 高度分化細胞經(jīng)過一定技術(shù)處理，也可以回復(fù)到類似受精卵時期的功能在胚胎和個體發(fā)育中，細胞質(zhì)具有調(diào)控細胞核發(fā)育的作用無法培育出相同個體/克隆動物的 基因來源:受體細胞的細胞質(zhì)基因控制性狀表達細胞分裂中基因突變 環(huán)境因素3.動物細胞融合比較項 目細胞融合的 原理融合前處 理

21、誘導(dǎo)手段應(yīng)用植物體 細胞雜 交細胞膜流動 性植物細胞全 能性獲得原生質(zhì)體(1)物理：離心、 電刺激、振揚(2)化學(xué)：聚乙 二醇克服了遠緣 雜交的不親和 性研究質(zhì)遺傳動物細 胞融合細胞膜流動 性細胞增殖細胞分散(1/2)植物物化 手段(3)滅活的仙臺 病毒制備單克隆抗 體細胞融合時可出現(xiàn)多種雜種細胞專題3 胚胎工程胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子(針對胚胎發(fā)育過程)所進行的多種顯微操作和處理技術(shù)；研究對象主要限定于高等脊椎動物、尤其是哺乳動物：重點內(nèi)容包括胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等。(一)動物胚胎發(fā)育的基本過程1、受精作用：成熟的精卵融合成為受精卵的過程(獲能精子+減II中期

22、的成熟卵細胞)過程：精卵識別、精子附著于卵膜、精卵質(zhì)膜融合受精時精卵質(zhì)膜融合后，次級卵母細胞才最終完成減II ,精卵核融合場所：輸卵管上段2、胚胎發(fā)育：受精卵發(fā)育到幼體胚后發(fā)育：出生到性成熟個體發(fā)育：受精卵發(fā)育到性成熟3、動物胚胎發(fā)育的基本過程（1）卵裂期（28）:細胞數(shù)量增加，有機物總量/總體積減小，每個細胞都具有全能性，未出現(xiàn)細胞分化，每個細胞都能發(fā)育成完整新個體（2）桑根胚（1632）（3）囊胚/胚泡：細胞開始分化，形成滋養(yǎng)層（胚胎附屬結(jié)構(gòu)/胚外結(jié)構(gòu)）和內(nèi)細胞團（胚胎干/ES細胞，發(fā)育全能性），之間為囊胚腔注意題目要求填寫滋養(yǎng)層細胞還是滋養(yǎng)層（4）原腸胚：三胚層分化，其將分化成各種器官原

23、基；哺乳動物胚胎有機物總量增加（胚泡期已著床），其他動物有機物減少PS早期胚胎（桑意胚和早期囊胚）（二）胚胎干細胞1、哺乳動物胚胎干細胞來源于囊胚內(nèi)細胞團（ES）或胎兒的原始性腺（EK）2、形態(tài)特征:具有胚胎細胞的特性，體積小，核大，核仁明顯，二倍體核型功能特征：具有發(fā)育全能性3、胚胎干細胞體外培養(yǎng)：分離早期胚胎中的內(nèi)細胞團；胰酶處理解離培養(yǎng)飼養(yǎng)層（胚胎成纖維細胞）：促進生長，抑制分化4、胚胎干細胞的主要用途是：基因敲除:用分化誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化，組織器官移植;治療人類的某些頑疾，修復(fù)壞死或退化的部位；胚胎干細胞核移植，經(jīng)胚激活、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植;改良和創(chuàng)造動物新品種(三)胚胎工程的應(yīng)用1.體外受精(1)卵母細胞的采集和培養(yǎng)：卵巢經(jīng)促性腺激素處理超數(shù)排卵，使用超聲監(jiān)視器確定卵泡位置,插入穿 刺針吸取卵泡液,取出卵母細胞(各階段卵母細胞均有可能)體外培養(yǎng)至成熟(減II中)(2)精子的采集和獲能(獲得能與卵細胞結(jié)合的能力)：獲能液由相關(guān)物質(zhì)組成 非ATP(3)受精：獲能精子和成熟卵細胞在體外合適環(huán)境中共同培養(yǎng)試管動物/珍稀動物保護(體外受精)Cf克隆動物(核移植)2 .胚胎體外培養(yǎng)：(1)由于胚胎不同發(fā)育時期生理代