1、醉母蔗糖的米氏常數的測定原理當環(huán)境的溫度、pH和酶濃度等條件恒定時，酶促反應的初速度 V隨底物的濃度S增高 而加快，直至達到一極限，即最大反應速度Vma為根據底物濃度和反應速度的這種關系，Michaelis-Menten 推導得出如下公式：_ VmaxSV = Km +S式中Km為米氏常數。它是酶的特征性常數。測定Km是研究酶的一項重要工作。大多數酶Km 10310-5mol/L左右。但是 Michaelis-Menten 方程中反應速度 V與底物濃度S 之間為雙曲線關系，通過作圖求Km值極不方便。Lineweaver-Burk 根據米氏方程又推導出如下直線方程：1Kmi1=+V Vmax S

2、 Vmax以1/S為橫坐標，1/V為縱坐標，將各點連成一直線，此線向左延長與橫軸相交處即 為米氏常數（Km的負值。本實驗是用比色法測定一定時間內、 一定量的蔗糖酶作用于不同濃度的底物（蔗糖）生1Km成產物的量，即葡萄糖的量。此產物的生成量為反應速度，然后按Lineweaver-Burk雙倒數 作圖法作圖（圖14）,就可以求出 Km值。S圖14 Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法試劑1. 0.03mol/L蔗糖溶液。2. 0.2mol/L pH5.0 醋酸緩沖液：取 0.2mol/L 醋酸鈉溶液 70ml與0.2mol/L 乙酸溶液 30ml相混合。3.蔗糖酶溶液：干酵母 2.5g置研

3、缽中，加蒸儲水 4ml,用力研磨10分鐘，轉移到離心管 中，用25ml蒸儲水洗研缽，并將洗滌液一起轉移到離心管中，搖勻，靜置 50分鐘，離心 (2000r/min 5min )，小心取出上清夜備用。置冰箱保存。實驗時根據需要用蒸儲水適當稀釋。(約25倍稀釋)4 .堿性硫酸銅溶液：取無水Na2CO40g溶于400ml蒸儲水中；酒石酸 7.5g溶于350ml蒸儲水中；結晶硫酸銅(CuSO 5HO) 4.5g溶于200ml蒸儲水中，以上分別加熱促溶。冷 卻后將酒石酸溶液傾入Na2CO溶液中，混勻。再將硫酸銅溶液傾入，并加蒸儲水至總量為1000mlo此試劑可在室溫中長期保存。如放置數周后生成沉淀，可用

4、優(yōu)質濾紙過濾后使用。5 .磷鋁酸試劑：燒杯內加入鋁酸 70g,鴇酸鈉10g,10%NaOH400ml及蒸儲水400ml。 煮沸2040分鐘以除去鋁酸內可能存在的氨。 冷卻移入1000ml容量瓶內，加濃磷酸(85%) 250ml,混勻。最后以蒸儲水稀釋至 1000ml o6 .葡萄糖標準溶液(0.05mg/ml )：(1)葡萄糖標準貯存溶液：(10 mg/ml)：以分析天平稱取1.000g純葡萄糖，置于小燒 杯中加0.25%苯甲酸溶液使溶解，傾入100ml容量瓶中以0.25%苯甲酸溶液稀釋至刻度。(2)葡萄糖標準應用液(0.05mg/ml )：用吸管吸取上述葡萄糖標準貯存液5.0ml放入1000

5、ml容量瓶內，用0.25%苯甲酸溶液稀釋致刻度。主要器材1 .恒溫水浴及沸水浴2 . 721分光光度計主要操作步驟1 .將蔗糖酶溶液置 30 c水浴預溫5分鐘。2 .取試管5支，編號，按表14操作。表14試劑(ml)123450.03mol/L蔗糖溶液5.02.51.51.00蒸儲水02.53.54.05.0pH5.0醋酸緩沖液0.50.50.50.50.5充分混勻，30 C水浴預溫5分鐘蔗糖酶溶液0.50.50.50.50.5立即混勻，30 C水浴準確保溫10分鐘堿性硫酸銅溶液1.01.01.01.01.0混勻，中止酶反應。另取試管6支，編號。向15管加入上面相對應的 5管反應液各0.5ml

6、,再各加蒸儲水1.5ml;第6管加入葡萄糖標準液 2ml。然后按表15操作：表15管號試齊J (ml)123456堿性硫酸銅溶液2.0 2.02.02.0 2.0 2.0混勻，置沸水浴8分鐘，取出冷卻磷鋁酸試劑2.0 2.02.02.02.0 2.0混勻，靜置3蒸儲水2.0 2.02.0 2.02.0 2.0將各管混勻，選用420nm波長比色，以第5管作為空白管調零，第 6管作為標準管，記 錄各管光密度。結果與計算酶促反應所產生的還原糖的mol數按下式計算:測定管光密度7 n1000還原糖（mol） =X 0 1 X 二0-X000標準管光密度0 5180按照Lineweaver-Burk 作圖法，以1/S為橫坐標，10分鐘內