1、銀杏黃酮對(duì)三氯化鋁致老年性癡呆模型大鼠的作用    【關(guān)鍵詞】銀杏黃酮;學(xué)習(xí);記憶;小鼠 Ginkgoflavonoidsonthreealuminumchloride-inducedAlzheimer'sdiseasemodelrats YangGuorong,Paneither GuangzhouUniversityofChineseMedicine,GuangdongProvince,theFirstAffiliatedHospital,510405 【Abstract】Objective Tostudytheflavonoidsofthe

2、threealuminumchlorideinduceddementiamodelrathippocampusinlearningandmemoryabilityand-APP-positiveneuronsintherat,withaviewtoexploretheflavonoidsofanti-Alzheimer'sdiseaseinrats.Methods ofaluminumchloride-inducedAlzheimer'sdiseasemodelratsastheexperimentalobjects,theirlearningandmemoryability,

3、dorsalhippocampusanddentategyrusin-APPpositiveneuronsinthenumberofindicators,acomprehensivesurveyofGinkgoflavonoidsagainstage-relatedTheroleofdementia.Results flavonoids(100,200,400mg/kg,ig),cansignificantlyagainstAlzheimer'sdiseasemodelofthedeclineinlearningandmemoryabilitiesinrats,inhibitdorsa

4、lhippocampusanddentategyrusin-APPpositiveneuronsinthegeneration.Conclusion ginkgoflavonoidsonthreealuminumchloride-inducedAlzheimer'sdiseasehavesignificantimprovement. 【Keywords】Ginkgoflavonoids;Learning;Memory;Mice 銀杏黃酮(Ginkgoflavone)是從中草藥銀杏葉中提取分離的有效成分。臨床及藥理研究1-3表明,銀杏黃酮對(duì)老年性癡呆有一定的治療作用,能對(duì)抗老年性癡呆所導(dǎo)

5、致的學(xué)習(xí)記憶能力的降低,認(rèn)為作用機(jī)制可能是使老年性癡呆病人腦組織中M1受體上調(diào)。但老年性癡呆是個(gè)綜合過(guò)程,涉及機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)、不同結(jié)構(gòu)層次的多項(xiàng)指標(biāo)。本文采用三氯化鋁所致的老年性癡呆模型大鼠考察了銀杏黃酮的促智及抑制-APP陽(yáng)性神經(jīng)元生成的作用。 1材料 1.1動(dòng)物Wistar大鼠,雄性,200220g,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào):SCXK(滬)2003-2002。 1.2藥品與試劑銀杏黃酮:沈陽(yáng)藥科大學(xué)植化教研室提供。結(jié)晶三氯化鋁:沈陽(yáng)市試劑三廠(批號(hào):20001201)。多聚甲醛:中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司(批號(hào):990020)。單克隆抗-APP:ZYMED公司(批號(hào):

6、20873083)。SA1021-即用型SABC免疫組化染色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào):200210)。 1.3儀器大鼠跳臺(tái)箱:DBA-2型,醫(yī)科院藥物研究所。OLYMPUSBH-2型光學(xué)纖維鏡:日本OLYMPUS光學(xué)有限公司。Leitzl512型石蠟切片機(jī):德國(guó)Leitz公司。LX-1型醫(yī)用溶蠟箱:天津市三水科學(xué)儀器有限公司。 2方法 2.1三氯化鋁致老年性癡模型的建立取健康大鼠50只,隨機(jī)分為5組:正常組、模型組及3個(gè)給藥組。除正常組外其余各組灌服AlCl3500mg/(kg #8226;d),正常組灌服等容積的蒸餾水,第30天時(shí)用大鼠避暗法考察癡呆形成程度,待模型形成后,給

7、藥組灌服Alcl3的同時(shí)給予不同濃度的銀杏黃酮,連續(xù)75天。第75天開(kāi)始進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn),第80天處死大鼠,測(cè)定背海馬和齒狀回內(nèi)含淀粉樣前體蛋白(-APP)神經(jīng)元的個(gè)數(shù)4-6。 2.2癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定-跳臺(tái)法7-8 跳臺(tái)箱底部為電柵板,箱內(nèi)有一高10cm的平臺(tái)。條件刺激為鈴聲,非條件刺激為足底電擊。其程序?yàn)殁徛?s,繼之以電擊10s,間隔20s。大鼠受到電擊跳上平臺(tái)稱(chēng)之為被動(dòng)回避反應(yīng);聽(tīng)到鈴聲而未遭到電擊之前跳上平臺(tái)稱(chēng)之為主動(dòng)回避反應(yīng)。每天訓(xùn)練10次,記錄主動(dòng)回避反應(yīng)的次數(shù)。 2.3大鼠海馬中含淀粉樣前提蛋白神經(jīng)元計(jì)數(shù)法大鼠以20%烏拉坦麻醉后,打開(kāi)胸腔,灌流針頭自左心室插入主動(dòng)脈,先以

8、生理鹽水沖洗出血液,以輸液器注入4%多聚甲醛。固定后立即取出大腦,置4%多聚甲醛中固定13h,以70、80、90、95%的乙醇各脫水3h,無(wú)水乙醇脫水兩次,每次20min,此后以元水乙醇和二甲苯的混合液處理10min,二甲苯4min,進(jìn)行透明。60以下埋入石蠟中。切片,37恒溫箱中烤片,常規(guī)脫臘至水后,以蒸餾水配制的3%H?2O?2,室溫下泡510min以滅活內(nèi)源性酶,再以蒸餾水洗3次。再次切片泡入0.01M的枸櫞酸鹽緩沖液中,電爐加熱至沸騰后斷電,間隔5min后,反復(fù)2次,冷卻后以0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌2次。此后滴加正常山羊血清封閉液,室溫保持20min。甩去多余液體,滴加一抗(單克隆抗

9、-APP,1100),4過(guò)夜。0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌3次后,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,2037,30min,0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌3次后,用3,3-二氨基苯聯(lián)胺顯色5min,蒸餾水洗滌。最后以蘇木素復(fù)染30s,脫水,透明,封片。光鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)背海馬和齒狀回內(nèi)含淀粉樣前提蛋白神經(jīng)元的個(gè)數(shù)9。        2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)采用?x±s?表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。 3結(jié)果 3.1Ginkgoflavone對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)在訓(xùn)練的各

10、天沒(méi)有明顯提高;與模型組比較,銀杏黃酮高、中、低3個(gè)劑量組大鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)在訓(xùn)練的各天均有顯著升高。結(jié)果表明,三氯化鋁可明顯損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程;銀杏黃酮對(duì)癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用10。 3.2Ginkgoflavone對(duì)癡呆大鼠背海馬和齒狀回內(nèi)-APP陽(yáng)性神經(jīng)元的作用與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠背海馬和齒狀回內(nèi)-APP陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增加。與模型組比較,銀杏黃酮高、中、低3個(gè)劑量均可使大鼠背海馬和齒狀回內(nèi)-APP陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少11。 4討論 用慢性鋁中毒的方法建立老年學(xué)習(xí)記憶障礙模型是研究老年性癡呆較為理想的模型之一12。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究表明,三氯化鋁可明顯降低大鼠

11、的回避反應(yīng)率,抑制回避反應(yīng)的保留。鋁可進(jìn)入腦內(nèi)取代鈣和鎂離子,同氨基酸鏈上的谷氨酸或精氨酸的羧基結(jié)合形成谷氨鋁鹽或精氨酸鋁鹽的穩(wěn)定復(fù)合物而沉積于腦內(nèi),引起雙螺旋纖維蛋白異常磷酸化反應(yīng),形成神經(jīng)元纏結(jié),引起A的形成而產(chǎn)生老年斑,最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡13。而A是由-APP產(chǎn)生的,因此,可以通過(guò)抑制-APP的產(chǎn)生而達(dá)到治療老年性癡呆的目的。本研究表明:銀杏黃酮可以有效對(duì)抗三氯化鋁所致的老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的降低,具有明顯的促智作用;可明顯減少癡呆大鼠背海馬和齒狀回內(nèi)-APP陽(yáng)性神經(jīng)元的個(gè)數(shù),對(duì)海馬神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用,但其確切的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究14-15。 參考文獻(xiàn) 1BraquetP.D

12、rugsFut1987,12(7):63 2鐘雪廬,樂(lè)嘉賡.我國(guó)開(kāi)發(fā)銀杏葉制劑現(xiàn)狀與前景J.中國(guó)藥房,1994,5(5):3 3楊義方,顏鋒.銀杏葉及其制劑開(kāi)發(fā)近況J.中成藥,1995,17(11):40 4王成章,郁青,譚衛(wèi)紅,等.溶劑萃取銀杏內(nèi)酯的因子研究J.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1998,11(2):53 5盧元芳,宮霞.銀杏葉黃酮類(lèi)化合物的提取和藥理作用J.曲阜師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,25(3):95 6馮曉萍,查忠勇,王槐三,等.銀杏葉黃酮提取工藝研究現(xiàn)狀J.四川化工與腐蝕控制,2002,5(2):13 7張春秀,胡小玲,盧錦花,等.銀杏葉黃酮類(lèi)化合物的提取分離J.化學(xué)研究與應(yīng)用,2001,13(4):454 8莊玲華,李暉.銀杏葉活性成分的提取分離研究J.華西藥學(xué)雜志,2002,17(6):437 9劉志敏,趙鎖奇,王仁安.超臨界流體色譜測(cè)定銀杏葉中的黃酮J.分析化學(xué),1999,27(2):214 10孫云鵬,孫明華,孫傳經(jīng).超臨界CO2從銀杏葉中萃取黃酮和萜內(nèi)酯的方法P.CN1172670A,1998 11郭國(guó)瑞,謝義榮,鐘海山,等.超聲波提取銀杏黃酮苷的工藝研究J.贛南師范學(xué)院學(xué)報(bào),