1、微陣列比較基因組雜交技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用 【摘要】 微陣列比較基因組雜交(array-CGH) 技術(shù)是將DNA克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH法中中期染色體作為雜交靶，不僅使分辨率提高，甚至可以確定腫瘤相關(guān)基因并提供精確的定位。全文綜述Array-CGH的原理、方法及其在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用和意義。 【關(guān)鍵詞】 微陣列-比較基因組 微陣列比較基因組雜交(array-comparative genomic hybridization，Array-CGH)技術(shù)是將DNA 克隆或cDNAs做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH檢測中將中期染色體作為雜交靶進(jìn)行檢測，不僅使分辨率提高，而且還可以確定腫瘤相

2、關(guān)基因并提供精確的定位。同時可經(jīng)計算機(jī)軟件識別每條染色體，克服了需要經(jīng)驗(yàn)豐富的人員識別染色體的限制，為快速全面地分析腫瘤組織DNA 拷貝數(shù)的變化，以及染色體不穩(wěn)定性的檢測提供了較為理想的方法。本文就該技術(shù)原理、方法及其在腫瘤研究中的應(yīng)用作一簡單的綜述。 1 微陣列比較基因組雜交概述 1.1 Array-CGH基本原理 Array-CGH與CGH相似，但它是用DNA克隆或cDNAs微陣列代替中期染色體鋪片作為雜交靶，即將等量的不同熒光標(biāo)記的待測和參照DNA經(jīng)人Cot-1DNA封閉非特異性重復(fù)序列后，同時雜交到由DNA克隆或cDNAs組成的微陣列上。用微陣列每個靶點(diǎn)上的兩種信號的熒光比例反映待測基

3、因組DNA在相應(yīng)的序列或基因上的拷貝數(shù)變化15。 1.2 方 法 微陣列可以為DNA克隆微陣列和cDNAs微陣列。DNA克隆是在BAC、PAC 或YAC載體中克隆的DNA片段。cDNAs 微陣列，可以從樣本中提取總 RNA，再分離mRNA，然后將得到的cDNAs進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用專門的儀器將 DNA克隆或cDNAs點(diǎn)樣至覆蓋特定介質(zhì)的玻片上，按照在染色體中的分布，確定靶點(diǎn)的排列順序。為了得到精確的結(jié)果,每個靶點(diǎn)可重復(fù)點(diǎn)樣210次。點(diǎn)樣后，立即將玻片在80烘烤10min，制成微陣列玻片，存儲在帶有干燥劑的盒子里，室溫保存1，2，47。 待測 DNA可以來自腫瘤細(xì)胞系、冷凍或石蠟包埋的腫瘤組織。應(yīng)

4、盡可能選擇具有典型組織學(xué)特征的腫瘤細(xì)胞，棄除壞死組織和炎癥區(qū)及周邊正常細(xì)胞，以免干擾。使用標(biāo)準(zhǔn)的酚氯仿異戊醇提取法分離腫瘤細(xì)胞和組織中的 DNA。對于甲醛固定、石蠟包埋組織,可以用激光捕獲顯微切割法（LCM）獲得腫瘤組織，提取DNA，再用變性引物介導(dǎo)的PCR（DOP-PCR）擴(kuò)增和標(biāo)記8，參照 DNA來源于健康人血液中的白細(xì)胞或同一患者同一器官中正常組織。對探針可以進(jìn)行直接或間接熒光標(biāo)記。標(biāo)記方法有以下幾種：缺口平移法；隨機(jī)引物法；DOP-PCR法；順鉑熒光素連接法1，9等。標(biāo)記完成后用SephadexG5旋轉(zhuǎn)柱去除未結(jié)合的核苷酸1。 將不同熒光標(biāo)記的待測和參照DNA（各1）與人Cot-1（6

5、0）混合，封閉非特異重復(fù)序列，降低本底作用。然后將待測和參照DNA 80熱變性10min。37孵育12h，再與已經(jīng)預(yù)熱的微陣列37雜交過夜，雜交后洗滌微陣列玻片，蓋上蓋玻片。對于DNA克隆微陣列，可以用DAPI復(fù)染，有助于定位靶克隆1，2，48。 用共聚焦掃描裝置或帶有冷光源相機(jī)的光學(xué)設(shè)備獲取圖像，并用專門的分析軟件處理數(shù)據(jù)。需要確定實(shí)際的靶區(qū)域、靶信號強(qiáng)度和局部背景強(qiáng)度。從靶信號強(qiáng)度中扣除局部背景得到靶熒光比例。將正常標(biāo)本在微陣列全部靶點(diǎn)的平均熒光比例調(diào)整為1，代表無DNA拷貝數(shù)變化。利用全部靶點(diǎn)的平均熒光比例（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）確定拷貝數(shù)變化的界限。獲得和缺失分別定義為（M+2s）和（M-

6、2s），高水平擴(kuò)增定義為（2M+2s）7。分析時去除在正常樣本中熒光信號不知的點(diǎn)（熒光信號高出背景20）和有過多熒光殘骸的點(diǎn)8。DNA拷貝數(shù)圖像可以用移動平均值（moving average）（5個相鄰的靶）顯示。移動平均值用于減少靶信號交叉引起的誤差和降低背景8，9。 1.3 可行性檢測和質(zhì)量控制 Urban等10用已知有-globin位點(diǎn)缺失的人用Array-CGH法進(jìn)行檢測驗(yàn)證Array-CGH檢測染色體基因組缺失或擴(kuò)增是否可靠，結(jié)果均檢測到了缺失的存在，證明該芯片系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地檢測基因或基因組的缺失。Veltman等11為用Array-CGH法檢測膀胱腫瘤患者DNA拷貝數(shù)變化，為確定該

7、技術(shù)及該芯片在檢測基因或基因組改變的可信性，先用正常人對正常人的組織進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果沒有缺失或擴(kuò)增的信號出現(xiàn)。而在膀胱癌患者的組織中檢測到了明顯有擴(kuò)增或缺失的信號發(fā)生。而這些缺失或擴(kuò)增的部位，含有相應(yīng)的癌基因或抑癌基因。證明此方法在檢測基因擴(kuò)增或缺失中，得出的結(jié)果是可信的。 1.4 Array-CGH的特點(diǎn) Array-CGH技術(shù)具有兩方面明顯優(yōu)勢：靈敏度和精確性：由于染色體DNA以高度密集和超螺旋的形式存在著，因此傳統(tǒng)CGH只有在DNA序列缺失達(dá)10Mb20Mb（細(xì)胞株）或20Mb30Mb（原發(fā)腫瘤）以上或序列擴(kuò)增時擴(kuò)增子與擴(kuò)增拷貝數(shù)之積至少2Mb才被檢測出來。故傳統(tǒng)CGH所提供的信息中必

8、然包含有為數(shù)眾多的基因，需要作進(jìn)一步的精確定位。Array-CGH避開了復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)，所雜交的靶序列僅為包含了少數(shù)基因的短DNA片段，所以能找出傳統(tǒng)CGH檢測不出的DNA序列拷貝數(shù)的差異，并同時將擴(kuò)增或缺失的范圍精確地定位在某個或某幾個已知基因或未知基因上。自動化、程序化：染色體帶型的復(fù)雜性和個體差異決定了核型分析不可能全部實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，必須依靠經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞遺學(xué)家對核型分析軟件得出的結(jié)果進(jìn)行校正后才能進(jìn)一步分析基因組的不平衡性。因此傳統(tǒng)CGH的技術(shù)受人為因素的限制，需要一定的經(jīng)驗(yàn)技術(shù)和勞動力支持。Array-CGH技術(shù)中不需要染色體核型的制備和分析，與普通的基因芯片檢測表達(dá)譜的過程一樣，其

9、結(jié)果完全可以由機(jī)器和計算機(jī)綜合分析后即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。 1.5 Array-CGH技術(shù)的分類 根據(jù)微陣列上所固化的核苷酸的性質(zhì)，Array-CGH可分為cDNA Array-CGH和DNA Array-CGH兩種類型。前者以常規(guī)的cDNA 微陣列為平臺，基因芯片表面固定的探針來自待測種屬的cDNA文庫。cDNA Array-CGH技術(shù)使得大規(guī)模、高通量研究基因的改變成為現(xiàn)實(shí)。DNA Array-CGH技術(shù)是直接將基因組DNA片段固化于芯片表面，因此靶序列上不但有基因編碼區(qū)，還包含了內(nèi)含子、重復(fù)序列、其他調(diào)控序列等非翻譯區(qū)，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的信息量。同時由于基因組DNA片段長

10、于cDNA片段，因而DNA Array-CGH的雜交信號強(qiáng)于cDNA Array-CGH，提高了實(shí)驗(yàn)的敏感度。但cDNA Array-CGH芯片制備相對容易，而DNA Array-CGH芯片上廣泛分布的表達(dá)序列標(biāo)簽也有助于所得序列進(jìn)一步純化和點(diǎn)陣。因此這兩種Array-CGH技術(shù)各有所長，在實(shí)際工作中可根據(jù)具體情況和實(shí)驗(yàn)要求作出選擇。 2 Array-CGH技術(shù)在腫瘤研究中作用 Array-CGH應(yīng)用超高密度和長寡核苷酸探針，對多種腫瘤相關(guān)染色體區(qū)域的DNA拷貝數(shù)變化具有較高的分辨率，從而可以找出基因組的改變，并可精細(xì)到基因和外顯子水平的改變；也可以檢測到很小范圍的基因擴(kuò)增和缺失以及小于500

11、堿基對的染色體斷點(diǎn)位置。該技術(shù)最新進(jìn)展，Nimblegene公司研制的芯片,在一芯片上含有385 000個探針，一次可以分析成千上萬個基因組的變化，甚至可以確定相關(guān)基因并提供精確的定位1214。 2.1 乳腺癌 應(yīng)用Array-CGH技術(shù)，得到許多乳腺癌DNA拷貝數(shù)變化的圖譜。Garcia等15應(yīng)用Array-CGH在乳腺癌的研究中，不僅證實(shí)了傳統(tǒng)CGH法探測到的8p1112上的擴(kuò)增和過表達(dá)區(qū)域與新發(fā)現(xiàn)FLJ14299，C8orf2， BRF2和RAB11FIP這四個基因密切相關(guān)，而且還認(rèn)為這四個基因是最好候選“始動”癌基因。Varma等16應(yīng)用Array-CGH研究不同地區(qū)及經(jīng)受核輻射的乳腺

12、癌患者基因拷貝數(shù)變化及基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)大量的以前沒有被報道過的乳腺癌癌前病變的突變基因，并確定了用來鑒別來自核放射性微塵地區(qū)乳腺癌患者的基因拷貝數(shù)的變化圖譜，發(fā)現(xiàn)共同擴(kuò)增的基因在8p13.2、1p21.1、8q24.21，而在1p36.22、17p13.2、8p23.3基因有缺失。 浸潤性導(dǎo)管癌和所有的浸潤性小葉性癌大約80的患者16q上都有部分基因缺失。共同的位點(diǎn)是在54.555.5Mb 和 57.458.8Mb。而丟失的峰值 (83%)卻發(fā)生在61.962.9Mb17。Pole等18應(yīng)用Array-CGH對48例乳腺癌患者及MDA-MB-134，MDA-MB-175，MDA-MB-361，T-47D和ZR-75-18p五個乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均有8p遠(yuǎn)端丟失并在4Mb處有倒置，近端100kb丟失，而在NRG1和11q片段之間可以檢測到3倍擴(kuò)增。乳腺癌中相當(dāng)部分的表現(xiàn)型獨(dú)特性可能歸因