1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上分子診斷學(xué)復(fù)習(xí)資料參照中國醫(yī)藥科技出版社（第二版）編寫1. 分子診斷學(xué):是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法來研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和 大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和依據(jù)。主要特點：直接以疾病基因為探索對象，屬于病因?qū)W診斷，對基因的檢測結(jié)果不僅具有描述性，更具有準確性； 可準確診斷疾病的基因型變異，基因表型異常以及由外源性基因侵入引起的疾病。靈敏度高，便于早期診斷及疾病預(yù)防；以基因分析為基礎(chǔ)，特異性高。發(fā)展簡史（三個階段）第一個階段：準備和醞釀階段 1953年前，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA

2、是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。（三個實驗：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗、體外轉(zhuǎn)化實驗、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗）、第二個階段：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、中心法則、PCR技術(shù)第三個階段：2001年，首張人類基因組序列圖譜及其他物種基因組序列的公布。基因組分、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的巨大技術(shù)進步，促進進入第三階段，即以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)。主要應(yīng)用：感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤的分子診斷，個體化醫(yī)療，其他如耐藥性、療效監(jiān)測，多基因疾病2.基因：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必學(xué)的全部核苷酸序列，是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位。分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA的編碼序列 調(diào)控基因：保證轉(zhuǎn)錄功

3、能起調(diào)控作用的非編碼序列操縱子（operon）操縱基因與其控制下的結(jié)構(gòu)基因共同組成的功能單位斷裂基因：指基因的內(nèi)部存在間隔區(qū)，間隔區(qū)的DNA序列與該基因所決定的蛋白質(zhì)沒有關(guān)系。間隔區(qū)又稱為內(nèi)含子。出現(xiàn)在成熟RNA中的有效區(qū)段為外顯子。重疊基因：指基因的開放閱讀框（ORF）存在一個或多個核苷酸重疊的基因跳躍基因：又稱轉(zhuǎn)座子，基因在染色體上的位置不固定，能由一條染色體跳到另一條染色體上。必須基因：生物體中存在的一些維持生物細胞生長所必需的基因，缺少或突變這些基因均能導(dǎo)致生物體死亡3.基因組（gnome）：細胞中一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和基因組結(jié)構(gòu)主要指不同的DNA功能區(qū)在DNA分子中的分布和排

4、列4.C值：基因組的大小又稱C值，常用堿基數(shù)目或堿基對數(shù)目來描述C值是特異的，物種不同，差異極大， 真核生物中，一般隨著進化，C值增大C值矛盾：又稱C值悖論，生物的進化程度與基因組大小不完全成比例的現(xiàn)象5.真核生物基因組1）基本特征：有細胞核基因組和細胞器基因組之分；核基因組以線狀DNA分子的形式存在于染色質(zhì)上；基因多數(shù)為斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和大量重復(fù)序列；單順反子，基因家族；核基因組由染色體DNA組成，分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與蛋白質(zhì)結(jié)合。注意點：染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，由組蛋白核心和周圍的DNA組成。組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個分子組成核心即組蛋白八聚體一個基因有n個內(nèi)含子

5、，則相應(yīng)有n+1個外顯子重復(fù)序列分為4類：單一序列、輕度重復(fù)序列（210個拷貝）、中度重復(fù)序列（1012個拷貝）、高度重復(fù)序列（1萬以上）多基因家族：一些有編碼功能的重復(fù)序列，即指起源相同，序列相似，功能相關(guān)的的一組基因，分為基因簇（相對集中分布在某一染色體的特定區(qū)域）和另一類基因家族成員在整個染色體上散在分布，甚至位于不同染色體超基因家族：由基因家族和單基因組成的較大的基因家族，結(jié)構(gòu)不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成員因突變而失活，不能表達出有活性的產(chǎn)物。6、人類基因組計劃（HGP）：旨在測出人類基因組30億堿基對的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并確定它們在染色體上的位置，破

6、譯人類全部遺傳信息，發(fā)展基因組學(xué)新技術(shù)，探討人類基因組研究的社會法律與倫理等問題的一個國際性研究項目。1） 主要任務(wù)：人類的DNA測序，包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜等的繪制2）測序策略：經(jīng)典的逐步克隆法、全基因組鳥槍法 3）人類基因組概貌：GC含量：平均41%（33%65%）CpG島：即二核苷酸CG染色體的重組率 基因突變率：男性多見重組序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、衛(wèi)星DNA、Tn等單核苷酸多態(tài)性（SNP）含量基因數(shù)量：2、6萬3、9萬個蛋白質(zhì)數(shù)量：選擇性剪接較多，使得蛋白質(zhì)多而復(fù)雜疾病基因 人基因組序列：99、99%相同 4）人類基因組多樣性：同一人種或不同人種

7、基因組存在或多或少的差異。 通常DNA分子中某一特定位點的變異頻率低于1%為基因突變，高于1%為DNA分子多肽。人類DNA分子多肽性的產(chǎn)生有以下幾種主要方式：重復(fù)序列單元的拷貝數(shù)變異，如微衛(wèi)星DNA多態(tài)性 轉(zhuǎn)座因子導(dǎo)致的分子多肽，如Alu序列多態(tài)性單個核苷酸的變異即SNP 7、原核生物基因組1）一般特點：基因組相對較小，通常為一條雙鏈DNA分子 功能相關(guān)的基因高度集中，構(gòu)成操縱子重復(fù)序列少，大多數(shù)的蛋白質(zhì)基因保持單拷貝形式，而RNA基因常是多拷貝沒有內(nèi)含子，基因是連續(xù)的多順反子，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位 絕大部分DNA都是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有很少不編碼序列 DNA分子中有各種功能區(qū)多順反子（polyci

8、stron）：操縱子中常常有一至多個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串連一起，受同一個調(diào)控區(qū)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄在同一個mRNA分子中。8、質(zhì)粒是多數(shù)細菌和某些真核生物細胞的染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子1）遺傳特性：雙鏈環(huán)狀DNA分子，且為共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）質(zhì)粒復(fù)制有賴于宿主細胞的復(fù)制，但其自身基因可控制合成的時限及拷貝數(shù)垂直傳遞 不影響宿主細胞代謝，但可能賦予宿主細胞新的表型治理的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。單向/雙向，單向，雙向。2)特性：質(zhì)粒的不相溶性：兩種不同質(zhì)粒如果利用同一復(fù)制和維持機制，會在復(fù)制和隨后向子代細胞分配的過程中相互競爭，因而不能在同一宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。這

9、兩種質(zhì)粒屬于同一不相容群（InC）。質(zhì)粒的穩(wěn)定性：質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)能穩(wěn)定存在不被丟失稱為質(zhì)粒的穩(wěn)定性。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性。質(zhì)粒的選擇性標記。3）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：在正常生長條件下，每個宿主細胞或每條染色體所對應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。由其攜帶的復(fù)制子決定。復(fù)制子是一個復(fù)制單位，包括復(fù)制起點及其相關(guān)的調(diào)控元件。質(zhì)粒的復(fù)制由復(fù)制子與調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用來啟動。4）松弛型質(zhì)粒：以RNA為調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒的復(fù)制不需任何自身編碼的蛋白質(zhì)，完全由宿主細胞提供的壽命較長的酶及其他蛋白質(zhì)因子來完成，這些質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細胞的控制，以所謂的“松弛”方式進行。屬高拷貝質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒：攜帶與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子相互作用的復(fù)制子的質(zhì)粒。屬低拷貝

10、質(zhì)粒。9.轉(zhuǎn)座因子：又稱可轉(zhuǎn)座元件，指能在基因組中從一個位點移至另一位點的DNA序列。1）轉(zhuǎn)座現(xiàn)象或移位：指由可移動因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座作用結(jié)果：a.導(dǎo)致宿主細胞基因組DNA的插入突變或基因重排，是毗鄰基因失活或表達水平下降。b.轉(zhuǎn)座因子被認為是基因組進化的重要推動力量，還可作為遺傳學(xué)研究及基因工程的工具。2）原核生物轉(zhuǎn)座因子的種類：插入序列（IS）、轉(zhuǎn)座子（Tn）、可轉(zhuǎn)移性噬菌體。IS：a.IS兩端有正向重復(fù)序列（DR）和反向重復(fù)序列（IR）；b.IR結(jié)構(gòu)的對稱使IS既可正向插入靶位點，也可反向插入靶位點；c.IS的中間位編碼序列，僅編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶，含有依賴p因子的轉(zhuǎn)錄終止信

11、號及終止密碼，從而導(dǎo)致插入位點的基因失活或表達水平下降。Tn：基因組中存在的能自主復(fù)制和位移的一些DNA序列。特點：a.兩端有反向重復(fù)序列；b.轉(zhuǎn)座后靶位點重復(fù)序列是正向重復(fù)序列；c.編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白；d.可以在基因組中移動。3）轉(zhuǎn)座類型：復(fù)制型轉(zhuǎn)座、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座過程中能夠復(fù)制，結(jié)果是供體與受體都有一個拷貝的轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶和解離酶。非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子不復(fù)制，直接從一個位點移到另一個位點，結(jié)果是供體失去一個轉(zhuǎn)座因子而受體得到一個轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶。10.病毒基因組：1>特點：只有一種核酸，4種類型，為雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA 核

12、酸大小差別較大（1.3×103bp3.6×106bp） 具有啟動子和操縱子結(jié)構(gòu) 具有重疊結(jié)構(gòu)2>結(jié)構(gòu)：帽子和poly（A）尾結(jié)構(gòu)，對RNA起保護作用，并于病毒感染性有關(guān) 黏性末端：基因組雙鏈兩端具有能夠互補的單鏈DNA部分 末端正向重復(fù)序列：又稱末端冗余，指病毒雙鏈DNA分子兩端有一段相同的核苷酸 末端反向重復(fù)序列（ITR）：指病毒基因組兩端的反向互補重復(fù)序列 重疊基因：指兩個或兩個以上基因的ORF共有一段DNA序列 分段基因：指病毒基因組由幾條不同的核酸分子組成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及雙鏈RNA病毒 CTR：即長末端重復(fù)序列，逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的dsD

13、NA中，兩端有CTR結(jié)構(gòu)11.核酸分子雜交基本原理：利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補配對原則形成異質(zhì)雙鏈的過程。（分子雜交可以發(fā)生在同源或異源的DNA鏈與DNA鏈之間，也可在RNA鏈與DNA鏈之間形成）12.核酸變性（denaturation）：指維系核酸雙鏈互補堿基對之間的氫鏈斷裂變成單鏈的過程，并不涉及共價鍵的斷裂。（黏度減小，浮力密度增大，260nm處紫外吸收增加，活性降低）（熱變形，酸堿變性，化學(xué)變性）Tm（melting temperature）：通常把熱變性過程中DNA變性一半所需要的溫度成為融解溫度。DNA的Tm值在8295之間Tm

14、影響因素：DNA的均一性，堿基組成，溶液的離子強度，pH，變性劑13.DNA復(fù)性（renaturation）：當變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開的互補單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。（許多理化性質(zhì)恢復(fù)，但熱變性后驟然冷卻，DNA則不可復(fù)性）退火（annealing）：熱變性后，將溫度緩慢降低而使DNA逐漸冷卻即可復(fù)性的過程。復(fù)性過程分兩步：成核作用（nucleation）和拉鏈作用（zippering）成核作用：兩條核酸單鏈隨機碰撞形成暫時局部雙鏈，如果局部雙鏈周圍堿基不能配對，則迅速解離，重新碰撞直到找到正確的互補序列，這個過程稱為成核作用。拉鏈作用：在成核的基礎(chǔ)上，兩條單鏈的其余部分堿基迅

15、速互補配對，就像拉鏈那樣形成完整的雙鏈分子。復(fù)性速度用Cot1/2衡量，Co：單鏈DNA的起始濃度（mol/L），t為時間（s），Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時間之和，與復(fù)性速度成反比，與DNA復(fù)雜度有關(guān)影響因素：DNA的分子大小和復(fù)雜度，離子強度，DNA的濃度，溫度14.探針（probe）：廣義上指的是能特異性與特定靶分子發(fā)生相互作用，并能被某些方法所檢測的分子核酸探針：指能與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補結(jié)合，并可用特殊方法檢測的被標記的已知核酸序列15.核酸探針的種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針1）基因組DNA探針：制備方法：a.分子克隆

16、 b.采用聚合酶鏈反應(yīng)擴增特定的基因組DNA片段 優(yōu)點：制備方法簡便、省時、易得，穩(wěn)定不易降解，標記方法多樣也較成熟2）cDNA探針：cDNA（complementary DNA）：指與mRNA互補的DNA分子，它是以mRNA為模板，遵循堿基互補配對原則，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成 優(yōu)點：基因組DNA優(yōu)點，不存在內(nèi)含子和其他高度重復(fù)序列，尤其適用于基因表達研究（但制備困難）3）RNA探針：雜交效率高，雜交分子穩(wěn)定，不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交較少，不易標記，易降解4）寡核苷酸探針：特點：a.根據(jù)實驗需要合成 b.長度一般為2050nt c.可以識別靶分子的單個堿基變化 d.特異性不高，雜交信號不強

17、 設(shè)計原則：a.探針長度一般2050nt b.剪輯成分，Gtc含量在40%60%為宜 c.不應(yīng)存在大于4bp的互補序列 d.避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于4次 e.同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個上堿基同源16核酸探針的標記，兩大類1） 放射性核素：最常用，靈敏度和特異性極高，但半衰期短，檢測時間長，污染環(huán)境非放射性核素：穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟、檢測時間短，但靈敏度2） 理想標記物： 高靈敏度 標記物與探針結(jié)合后，不影響堿基對的特異性，雜交體的穩(wěn)定性及其Tm值。檢測方法應(yīng)高靈敏度、特異、假陽性率低 標記物與探針結(jié)合后穩(wěn)定，保存時間長 標記物對環(huán)境無污染、對人體無損傷、價格低廉。17 放射性核素的標記 常用

18、32P 35S 3H 125I 131I1)類型特點： 32P:比放射活性 3.4×1014Bg/mmol.最常用。放射性強，釋放的粒子能量高，穿透能力強，靈敏度高，半衰期僅14.4d，射線散射嚴重而影像分辨率，影響結(jié)果分析。 35S：比放射活性5.55×1013Bg/mmol.釋放的粒子較32P稍低，半衰期87.1d，靈敏度比32P低，散射作用弱，分辨率較高，適用于原位雜交。3H：比放射活性1.07×1012Bg/mmol，釋放的粒子能量較低，半衰期12.1年，采用延長曝光時間的方法可產(chǎn)生本底低，分辨率高的結(jié)果，金庸與細胞原位雜交，可反復(fù)使用，對環(huán)境影響大。12

19、5I、131I：釋放粒子和射線，具有較高敏感性，較強分辨率，危害性大。2)標記法：采用體外標記法，包括化學(xué)法和酶法 化學(xué)法：利用標記物分子和探針分子上活性基團間的化學(xué)反應(yīng)，將標記物結(jié)合到探針分子的標記方法。 酶法：預(yù)先將標記物標記在核苷酸分子上，經(jīng)過酶促反應(yīng)將標記號的核苷酸分子或標記基因摻入或交換到探針分子中的方法，有切口平移法，隨機引物法，末端標記法，PCR標記法。切口平移法：DNaseI Mg2+ 隨機切割 3OH引物 EcoliDNA聚合酶I d NTP 切除5端的核苷酸 合成互補單鏈隨機引物法：隨機引物是人工合成的由6個核苷酸殘基構(gòu)成的寡核苷酸片斷的混合物。Klenow酶末端標記法：1

20、）3端標記法：限制性內(nèi)切酶、klenow酶 2） 5端標記法; T4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）標記法、堿性磷性磷酸酶（ALP）切除5端的磷酸基團 PNK作用轉(zhuǎn)移18.非放射性核素標記：生物素、地高辛、光敏生物素、熒光素、酶標法（ALP HRP） 19.核酸探針的檢測： 放射性：放射自顯影 液體閃爍計數(shù)法 非放射性： 偶聯(lián)反應(yīng)、顯色反應(yīng)（酶促顯色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法）20.核酸分子雜交的類型：固相雜交和液相雜交兩大類 1）液相雜交：將待測核酸樣品和核酸探針同時放入雜交液中進行反應(yīng)，然后分離雜交分子和過量的未雜交探針，再對雜交結(jié)果進行檢測 固相雜交：預(yù)先將待測的靶核酸鏈固定在固相支持物上，然后

21、與溶解于雜交液中的核酸探針進行雜交反應(yīng)，洗去支持物上未參加反應(yīng)的游離核酸探針，再檢測雜交信號，分析結(jié)果。2）常用固相雜交：Southern EP跡雜交 NorthernEP跡雜交、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、原位雜交3） Southern EP跡雜交:指經(jīng)凝膠電泳分離的待測DNA片斷轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物，然后用標記的探針DNA分子檢測靶DNA的一種方法。基本過程：限制性核酸內(nèi)切酶消化待測DNA瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷DNA變性并轉(zhuǎn)印到固相支持物上預(yù)雜交與特異DNA探針雜交雜交信號檢測及結(jié)果分析常用固相支持物：尼龍膜、硝酸纖維素膜。（1）Northern印記雜交：指待測RNA（主

22、要是mRNA）從凝膠轉(zhuǎn)印到固相支持物上，與標化的DNA探針進行雜交的印跡技術(shù)。與Sowthern印跡雜交不同點：a . RNA易被環(huán)境中存在的RNA酶降解，應(yīng)避免RNA酶污染 b. RNA需要在變性劑存在下進行電泳，保持其單鏈狀態(tài)，防止RNA分子形成二級結(jié)構(gòu)，不能用堿變性 c. 印跡前將含有變性劑的凝膠用水浸泡除去。21. 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是指生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項技術(shù)之一（細胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴增技術(shù)）特異，敏感，高效，簡便，重復(fù)性，移易化等優(yōu)點。22.PCR的原理：模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程，通過

23、變性，退火，延伸，三步反應(yīng)的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA通過變性解鏈為單鏈，特異的引物通過退火與單鏈DNA模版結(jié)合，在靶DNA的指導(dǎo)下引物的3端延伸靶DNA的互補鏈完成一個循環(huán)，理論上每次循環(huán)結(jié)束后靶DNA擴增一倍，即靶DNA數(shù)目以2 幾何級數(shù)方法。（1）反應(yīng)體系：模版DNA，四種dNTP，引物，TaqDNA聚合酶、緩沖液（含Mg2+）（2）變性（denaturation）:模版DNA經(jīng)加熱至95左右一定時間后，使模版DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈。退火（annealling）:將下降至適宜溫度（一般較Tm低5）引物與變性的DNA單鏈在堿基互補的基礎(chǔ)上形成引物，模版

24、雜交雙鏈。延伸（exension）:將溫度上升至在70左右時，TapDNA聚合酶催化以引物為起點的從53端DNA鏈延伸反應(yīng)，隨著4種dNTP的摻入，合成新的DNA互補鏈。（3）動力學(xué)：y=A(1=R) 估算PCR產(chǎn)量，A為起始模板量，R為擴增效率23.擴增產(chǎn)物的檢測與分析（1）凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。（2）PCR產(chǎn)物的酶切技術(shù)：PCR限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）（3）PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（4）核酸探針雜交分析（5）PCR-酶聯(lián)免疫吸附法（6）PCR產(chǎn)物測序25.PCR衍生技術(shù)：巢式PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR，錨定PCR，反向PCR

25、，免疫PCR，原位PCR，定量PCR（QPCR）26.熒光定量PCR技術(shù)：（1）基本原理：基于熒光能量傳遞技術(shù)，通過對PCR擴增反應(yīng)每個循環(huán)結(jié)束時產(chǎn)物熒光信號的檢測，對起始模版進行定量分析。2）實時熒光定量（real time FQ-PCR）：在熒光定量PCR反應(yīng)中，引物的熒光化學(xué)物質(zhì)，在每經(jīng)過一個循環(huán)后，產(chǎn)生一個熒光強度信號，利用熒光信號累積及熒光強度變化實現(xiàn)對整個PCR過程實現(xiàn)監(jiān)測。熒光閾值：設(shè)定在熒光擴增曲線上處于熒光信號指數(shù)擴增階段是的任意一個值，一般熒光閾值設(shè)置在3-15個循環(huán)內(nèi)Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系3）熒光

26、定量PCR技術(shù)：熒光染料法和熒光探針法 常用染料：SYBBGreenI 探針法：TaqMan技術(shù)，lightCycler探針技術(shù)，分子信標技術(shù)，復(fù)合探針法各法原理圖見P86-88P90 表5-4 不同核酸擴增技術(shù)比較27.實驗區(qū)分為四個獨立的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)，標本制備區(qū)，擴增區(qū)，擴增產(chǎn)物分析區(qū)四個基本原則：1.四個區(qū)域必須是相互獨立的，2.各區(qū)的儀器設(shè)備及物品必須是專用的，3.各區(qū)不能直通，應(yīng)沒有緩沖間，4.產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)安裝排風扇或其他抽風裝置 十六字口訣：各區(qū)獨立，注意風向，因地制宜，方便工作。還應(yīng)設(shè)立臨床標本接收區(qū)28.室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）室外質(zhì)量控制（EQC）IQC:包括測定

27、前的質(zhì)量控制，統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制，質(zhì)量控制的評價等29DNA序列測定：即DNA一級結(jié)構(gòu)的測定，指用人工的方法測定并分析核酸的堿基組成及排列順序。它是研究基因結(jié)構(gòu)，功能及其關(guān)系的前提，是臨床疾病的分子診斷最為精確的判定依據(jù) 四種常用方法：Sanger雙脫氧鏈末端終止法，Manxam-Glibert化學(xué)降解法，焦磷酸測序技術(shù)，雜交測序法各原理及圖見P100，103，105，106自動化測序與傳統(tǒng)方法比較1標化物不同： 熒光染料（自動） 放射性核素（傳統(tǒng)）2.加樣方式不同： 3.監(jiān)測手段不同： 掃描儀 放射自顯影 PCR循環(huán)測序反應(yīng)方法 酶反應(yīng)方法 集束話的毛細管電泳 凝膠電泳特點：簡便，快速，結(jié)果準確

28、可靠，安全無污染，測序能力增強30、生物芯片技術(shù)：指通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬密集排列的分子微陣列，以實現(xiàn)對組織、細胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物分子進行高效、準確、高通量檢測（微陣列芯片、微流體芯片） 常用：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片、液相芯片、微縮芯片實驗室等。31、基因芯片（Gene Chip）：又稱DNA芯片，DNA微陣列；將大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在載體上制成點陣，稱之為芯片。 其原理：經(jīng)過標記的待測樣品DNA通過與芯片上特定位置的探針按堿基配對原理雜交后，經(jīng)激光聚集熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過檢測雜交信號強度來獲取樣品分子的數(shù)量和序列信

29、息，用計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較和分析，從而對基因序列及功能進行大規(guī)模、高通量研究。 主要包括四個基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備及標記、樣品與基因芯片的雜交、信號的檢測及分析。32、蛋白質(zhì)芯片：指固定于支持節(jié)制上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的陣列。據(jù)用途分：蛋白質(zhì)功能芯片、蛋白質(zhì)檢測芯片。據(jù)載體分：蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白芯片、三位凝膠塊芯片。還可分：抗體芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、適配體芯片。33、組織芯片：也稱組織微陣列（TMA），將成百上千個不同組織標本按預(yù)先設(shè)計的順序排列固定在一張載玻片上所成的微陣列。34、液相芯片：又稱懸浮陣列，流式熒光技術(shù)，是基于XMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平

30、臺。其核心技術(shù)是把微小的聚苯乙烯微球用熒光染色的方法進行編碼，然后將每種顏色的熒光編碼微球共價交聯(lián)上針對特定檢測物的寡核苷酸或蛋白質(zhì)探針。 優(yōu)點：僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子最突出優(yōu)點高通量、高效率靈敏度高線性范圍寬重復(fù)性好操作簡單靈活性好35、微縮芯片實驗室：又稱微型生物（全：這個字不認識）分析系統(tǒng)（TAS） 把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所（波or譜：不認識）及的樣品制備，生物化學(xué)反應(yīng)和檢測分析的整個過程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成所謂的微型全分析系統(tǒng)。36、分子診斷法：（目的物：病原微生物的DNA或RNA） 對病原體特異性核酸序列的雜交，對病原體基因序列

31、的限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析，對病原體基因保守序列的擴增檢測基因芯片技術(shù)，支鏈DNA技術(shù)依賴核酸序列的擴增，連接酶鏈式反應(yīng)等。 乙型肝炎病毒：PCR 臨床意義：HBV感染的早期診斷，監(jiān)測治療效果，判斷病情，指導(dǎo)制訂合理的治療方案。其他方面結(jié)核分枝桿菌TB： TB DNA檢測可采用PCR，F(xiàn)QPCR，競爭性PCR，免疫雜交PCR等，PCRSSCP血紅蛋白病兩類：由于珠蛋白一級結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異常血紅蛋白病；由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中海貧血鐮狀細胞貧血：珠蛋白基因中第六位密碼子的序列由原來的GAC改變?yōu)镚TG，使對應(yīng)的氨基酸由原來的谷氨酸纈

32、氨酸 用RE酶切法診斷地中海貧血：分為地貧，地貧，地貧，地貧，地貧，地貧等，表型基因型見P195表11-2第一章： 概念 三個階段第二章： 一些基本概念及各基因組特點 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)坐因子 基因多態(tài)性 SNP第三章： 各酶概念及作用特點 載體概念 分類 常用載體及篩選方法 基本結(jié)構(gòu) 分子克隆的基本步驟及篩選方法第四章：核酸雜交基本原理 探針分類標記方法 常用標記物 雜交類型（Southhern Blot）第五章：PCR原理反應(yīng)體系及優(yōu)化 檢測與分析 常見問題的分析與處理 如何提高特異性 熒光定量PCR原理 探針 染料 P90表5-4實驗室分區(qū)第六章：序列的測定個方法的基本原理第八章：概念種類液相芯片

33、乙型肝炎病毒結(jié)核分枝桿菌血紅蛋白病（一）核酸的分離純化與鑒定：1、核酸分離制備總原則：保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性 盡量排除其他的污染，保證核酸的純度2、完整性鑒定：可采用凝膠電泳法，DNA看是否拖尾，RNA為2:1的關(guān)系3、核酸的保存：雙蒸水及TE緩沖液儲存DNA，醋酸鈉溶液或三蒸水、RNA酶儲存RNA4、抑制劑：抑制DNase：A、檸檬酸、EDTA等金屬螯合劑 B、加去污劑SDS C、加蛋白變性劑 抑制RNase：A、高溫高壓滅菌或用DEPC處理 B、加強的蛋白變性劑 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白5、技術(shù)路線的設(shè)計： （1）核酸的釋放 目的：裂解細胞、釋放核酸 物理方法：物理干燥法、凍融法、滲透壓

34、調(diào)節(jié)法 化學(xué)法：酶解法 （2）核酸分離純化：除去非核酸類大分子污染物 不需要的核酸 溶劑等 （3）核酸的濃縮沉淀洗滌：多價陽離子沉淀，70%-75%乙醇洗滌 （4）核酸的鑒定：紫外分光光度法檢測核酸的濃度及純度（>0.25ug/ml） 熒光分光光度法：溴化乙錠染料6、酚抽提法制備哺乳動物細胞DNA （前處理粗分離精分離） 1）、EDTA、SDS等存在下用蛋白質(zhì)酶K消化細胞 2）酚-氯仿抽提含核酸的水溶液，除蛋白質(zhì)3）氯仿抽提，取水相7、質(zhì)粒提取方法：堿裂解法、煮沸裂解、SDS裂解、CsCl8、蛋白酶K酚抽提法：（DNA） 勻漿組織（SDS、蛋白酶K、EDTA）酚氯仿抽提 水相/有機相取上

35、層水相乙醇沉淀重溶解DNA9、異硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法：（RNA） 勻漿組織苯酚-氯仿抽提離心后取上層水相乙醇沉淀DEPC水重新溶解RNA（4C/細胞裂解液、異硫氰酸胍、硫基乙醇、SDS） mRNA提取：Oligo(dt)-柱層析法第3章 分子克隆1 DNA重組：是指將不同來源的DNA分子通過磷酸二酯鍵將末端連接形成重組DNA.2. DNA克隆（分子克隆）：將某一特定DNA片段通過重組DNA技術(shù)插入到一個載體（質(zhì)粒和病毒等）中，然后在宿主細胞中進行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片段的群體。3. 分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶有：限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶

36、，堿性磷酸酶，多核苷酸激酶等。4. 限制性核酸內(nèi)切酶（RE）重要的工具酶之一。RE是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。1）RE命名與分類：命名：Hind H產(chǎn)生該酶的宿主菌屬名大寫，斜體in代表宿主菌的種名縮寫小寫，斜體d代表宿主菌的株或型正體代表同一種菌株中不同限制酶的編號（按發(fā)現(xiàn)先后順序）羅馬數(shù)字。分類：根據(jù)限制酶性內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)作用不同，可將其分為型型型。.型和型兼有修飾（甲基化）作用和依賴于ATP的活性，但不能在識別序列上直接裂解DNA，故用途較少，但型酶有其他特定用途。型酶具有高度特異性的DNA裂解點是基因工程和基因診斷中重要的工具酶，通常不特別說明即為型限制性內(nèi)切酶

37、。型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同酶組成。2）型限制性核算內(nèi)切酶的作用。P31-32,看表3-1.用途：改造和構(gòu)建質(zhì)粒繪制基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析。回問結(jié)構(gòu)：通常是雙鏈DNA分子中按對稱軸排列的反向互補序列。星號活力：RE在非標準條件下，能切割一些與其特異識別順序類似的序列，酶的特異性降低，這種現(xiàn)象稱為星號活力，使用時應(yīng)避免產(chǎn)生星號活力。同工異源酶：在DNA上，來源不同但能識別和切割同一位點的酶。5. DNA聚合酶.1）DNA聚合酶 和Klenow片段DNA聚合酶 是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個DNA聚合酶，分子量為.具有3種

38、酶活性：53聚合酶活性35核酸外切酶活性 5-3核算外切酶活性Klenow片段：用特異性的蛋白酶可將DNA聚合酶 裂解為小片段與大片段后者即Klenow片段，它具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，而失去了53外切酶活性，是分子生物學(xué)研究的常用工具酶Klenow片段的主要用途：補齊雙鏈DNA的3端，使3端標記；在cDNA克隆中，第二股鏈的合成；DNA序列分析TaqDNA聚合酶：最佳溫度是7080，Taq酶具有53聚合酶活性和依賴于聚合作用的53外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA測定及通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增（領(lǐng)域）逆轉(zhuǎn)錄酶：（多功能酶）P33圖3-

39、3功能：（1）依賴RNA的DNA聚合酶活性，以RNA為模版，4種dNTP為底物（此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3）以DNA為模版的DNA聚合酶作用末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）TdT功能：在載體或目的基因3端上加上互補的多聚體尾，形成便于重組的人工黏性末端用于DNA片段3端的同位素探針標記6.DNA連接酶主要有兩者：大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶輔基分別為 NAD+（只能連接黏性末端）ATP（既能連接黏性末端，又能連接平末端）重組DNA技術(shù)中常用T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最初來自受T4噬菌體侵染的大腸桿菌，但目前的分離純

40、化手段已能快速而又簡便的得到大量高度特異性酶。注意：DNA分子磷酸二酯鍵的斷裂稱為切口（Nick），可以用T4 DNA連接酶來修復(fù)。DNA分子中核酸缺失，稱缺口（gap），不能單獨用連接酶來修復(fù)。7.堿性磷酸酶常用兩種 細菌堿性磷酸酶（BAP）由大腸桿菌分離出來的 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）由牛腸道分離出來的（兩個催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團）主要用途：.除去DNA段上的5磷酸，以防自身連接。.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，除去RNA或DNA上5端的磷酸，以便進一步用32P標記的r-磷酸重新磷酸化，使5端段被32P標記。8. T4多核苷酸激酶（來源于T4噬菌體

41、感染的大腸桿菌）。 P35. 圖3-5. 包括前向反應(yīng)和交換反應(yīng)。9. 核酸酶S1:可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。作用：.除去雙鏈DNA的黏性末端以生產(chǎn)平末端。 .除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 .分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況等。（二）載體1.載體（vector）：是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具，本質(zhì)為DNA。.目前使用載體主要有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。.根據(jù)其用途不同分為克隆載體和表達載體兩類。.載體應(yīng)具有以下特征： 1）在宿主細胞中具有自主復(fù)制能力或能整合到宿主染色

42、體上與基因組一同復(fù)制的能力。 2）有合適的限制性酶切位點供外源DNA片段插入。載體上具有多個限制性酶的單一點（即在載體的其他部位無這些酶的相同切點）稱為多克隆位點。 3）載體應(yīng)賦予宿主某種十分明確的表型。 4）分子量不宜過大，以便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數(shù)，也有利于體外重組操作。 5）具有合適的篩選標記，以便于區(qū)分陽性重組體和陰性重組體，常用的篩選標記有抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷或形成噬菌斑的能力等。 6）配備與宿主相適應(yīng)的調(diào)控元件，入啟動子、增強子和前導(dǎo)序列等。2.克隆載體能將目的基因在受體細胞中復(fù)制擴增并產(chǎn)生大量目的基因的載體稱為克隆載體。常有兩種：質(zhì)粒載體和噬菌體載體 .質(zhì)粒載體：1） 生物學(xué)特性2） 復(fù)制特性：緊密型和松弛型（與宿主有關(guān)）3） 用途：1.用于保存課擴增2kb目的DNA。2.構(gòu)建cDNA文庫。3.目的DNA的測序。4.作為核酸雜交是的探針來源。作為克隆體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點：具有松弛型復(fù)制子；在復(fù)制子外存在幾個單一的酶切入點，以便目的DNA插入；具有插入失活的篩選標記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性標記；分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒缺點：容量較小，一般只能接受小于15kb的外來DNA。目前常用的質(zhì)粒有PBR322，PUC系列，以及由后者衍生而來的PSP和PGEM系列等。1）PBR322系列載體 P36 圖3-6看特點：帶