1、第二章第二章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 的構(gòu)建與操作技術(shù)的構(gòu)建與操作技術(shù) 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及使用方法組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及使用方法 培養(yǎng)基的制備方法和步驟培養(yǎng)基的制備方法和步驟 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù) 褐變和玻璃化原因及應(yīng)對措施褐變和玻璃化原因及應(yīng)對措施 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則：保證無菌操作，達(dá)到工作方便，防止污染。 實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模實(shí)驗(yàn)室的大小應(yīng)取決于工作的目的和規(guī)模 按按組織培養(yǎng)流程組織培養(yǎng)流程來設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引來設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂起日后工作混亂 利用一定的設(shè)備、

2、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，利用一定的設(shè)備、器材和特殊的實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，達(dá)到嚴(yán)格無菌的條件達(dá)到嚴(yán)格無菌的條件第一節(jié)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備第一節(jié)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室及主要設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與設(shè)備外植體外植體愈傷組織愈傷組織不定芽不定芽生根生根再生植株再生植株容器具洗滌，物質(zhì)準(zhǔn)備容器具洗滌，物質(zhì)準(zhǔn)備配置培養(yǎng)基并滅菌配置培養(yǎng)基并滅菌外外植體消毒與無菌操作接種植體消毒與無菌操作接種觀察、記錄、處理觀察、記錄、處理（脫分化、再分化、繼代）（脫分化、再分化、繼代） 再生植株再生植株標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的組培實(shí)驗(yàn)室的組培實(shí)驗(yàn)室洗滌室、準(zhǔn)備室、無菌室、培養(yǎng)室、觀察室洗滌室、準(zhǔn)備室、無菌室、培養(yǎng)室、

3、觀察室等等基本基本組培實(shí)驗(yàn)室組培實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室（含配藥室）、（含配藥室）、緩沖間緩沖間、無菌操作室無菌操作室、培養(yǎng)室培養(yǎng)室 功能：功能：進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作 器皿洗滌、藥品的配制器皿洗滌、藥品的配制 培養(yǎng)基配制與分裝培養(yǎng)基配制與分裝 培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌 培養(yǎng)材料的預(yù)處理等培養(yǎng)材料的預(yù)處理等 要求：要求： 明亮、通風(fēng)明亮、通風(fēng) 便于多人同時工作便于多人同時工作 地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)進(jìn)行防滑處理地面應(yīng)便于清潔，并應(yīng)進(jìn)行防滑處理1、準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）、準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）(1)(1)工作臺工作臺(2)(2)藥品柜藥品柜(3)(3)冰

4、箱冰箱 普通冰箱、低溫冰箱等。主要用于貯存母液、普通冰箱、低溫冰箱等。主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。等。(4)(4)天平天平 感量感量0.001g的分析天平、感量的分析天平、感量0.0001g的電子的電子天平（用于稱量微量元素和一些較高精確度的天平（用于稱量微量元素和一些較高精確度的實(shí)驗(yàn)用品）、感量為實(shí)驗(yàn)用品）、感量為0.1g的的托盤天平（用于稱取托盤天平（用于稱取用量較大的糖和瓊脂等）用量較大的糖和瓊脂等） 放置在水平、干燥、不受震動的操作臺上放置在水平、干燥、不受震動的操作臺上(5)(5)恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋(6)(6

5、)蒸餾水發(fā)生器蒸餾水發(fā)生器 蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基（普通實(shí)蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基（普通實(shí)驗(yàn)可以用自來水代替蒸餾水）驗(yàn)可以用自來水代替蒸餾水）(7)(7)電爐電爐(8)(8)高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋 進(jìn)行培養(yǎng)基、水和器械用具的滅菌進(jìn)行培養(yǎng)基、水和器械用具的滅菌不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）不銹鋼蒸餾水器（單蒸水）(9)(9)酸度計(jì)酸度計(jì) 測定培養(yǎng)基及酶制劑的測定培養(yǎng)基及酶制劑的pHpH值（普通實(shí)驗(yàn)值（普通實(shí)驗(yàn)可使可使用用pHpH試紙）試紙）(10)(10)烘箱烘箱 干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌 和測定干物重和測定干物重(11)(11)搖床搖床 振蕩培養(yǎng)振

6、蕩培養(yǎng)(12)(12)離心機(jī)離心機(jī) 分離培養(yǎng)基中的細(xì)胞以及解離細(xì)胞壁后的原分離培養(yǎng)基中的細(xì)胞以及解離細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體生質(zhì)體PHS-802中文臺式酸度計(jì)中文臺式酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)通用型或經(jīng)濟(jì)型酸度計(jì)全溫型恒溫培養(yǎng)搖床全溫型恒溫培養(yǎng)搖床多振幅高速軌道搖床多振幅高速軌道搖床、緩沖室緩沖室（注意門的朝向）（注意門的朝向） 工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩 功能功能 減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。 要求要求 緩沖間需緩沖間需3-5平方米，應(yīng)保持清潔無菌；平方米，應(yīng)保持清潔無菌； 有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過的工作

7、服；有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過的工作服； 1-2盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進(jìn)行滅菌。盞紫外燈定時照射，對衣物及空間進(jìn)行滅菌。、無菌操作室（接種室）、無菌操作室（接種室）功能功能 外植體消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原外植體消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備等生質(zhì)體的制備等要求要求環(huán)境干爽，清潔，居于上風(fēng)位環(huán)境干爽，清潔，居于上風(fēng)位 空間宜小不宜大空間宜小不宜大地面、天花板及四壁密閉光滑，無衛(wèi)生死角地面、天花板及四壁密閉光滑，無衛(wèi)生死角室內(nèi)物品越少越好，盡可能減少空氣流動室內(nèi)物品越少越好，盡可能減少空氣流動維護(hù)方法維護(hù)方法定期消毒（紫外線照射、氣霧熏蒸、藥品噴

8、灑）定期消毒（紫外線照射、氣霧熏蒸、藥品噴灑）及時維護(hù)（干燥、潔凈）及時維護(hù)（干燥、潔凈） 接種箱接種箱 主體為玻璃箱罩、入口有袖罩主體為玻璃箱罩、入口有袖罩 超凈工作臺超凈工作臺 操作臺面半開放，方便、操作舒適；通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大操作臺面半開放，方便、操作舒適；通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大于于0.03um0.03um直徑的微生物很難在工作臺的操作空間停留直徑的微生物很難在工作臺的操作空間停留 解剖鏡解剖鏡 分離微莖尖、轉(zhuǎn)基因等分離微莖尖、轉(zhuǎn)基因等 無菌操作用的器具無菌操作用的器具 酒精燈、鑷子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培養(yǎng)瓶，刀剪架等酒精燈、鑷子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培養(yǎng)瓶

9、，刀剪架等、培養(yǎng)室、培養(yǎng)室 功能功能 接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長的場所（其設(shè)計(jì)以充分（其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則）。利用空間和節(jié)省能源為原則）。 要求：要求： 能控制光照和溫度能控制光照和溫度 保持相對的無菌環(huán)境保持相對的無菌環(huán)境 有排風(fēng)窗和換氣扇等培養(yǎng)室的換氣裝置有排風(fēng)窗和換氣扇等培養(yǎng)室的換氣裝置 有適宜的培養(yǎng)架，日光燈照明。有適宜的培養(yǎng)架，日光燈照明。 主要設(shè)備主要設(shè)備 培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、空調(diào)機(jī)、除濕機(jī)、換氣扇、臭培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、空調(diào)機(jī)、除濕機(jī)、換氣扇、臭氧發(fā)生器等。氧發(fā)生器等。小型臭氧發(fā)生器小型臭氧發(fā)生器二、培養(yǎng)器皿及用具二、培養(yǎng)器皿及用具1 1、培養(yǎng)器皿

10、、培養(yǎng)器皿（包括（包括玻璃玻璃器皿和器皿和塑料塑料器皿）器皿） 各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。2 2、微孔過濾器、微孔過濾器（細(xì)菌過濾器）（細(xì)菌過濾器） 0.450.45微米，抽濾滅菌用，如激素微米，抽濾滅菌用，如激素3 3、器械用具、器械用具 鑷子、剪刀、解剖刀、接種針（鏟）等。鑷子、剪刀、解剖刀、接種針（鏟）等。思考題思考題 1 1、一個正規(guī)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備哪、一個正規(guī)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備哪些房間？些房間？ 2 2、組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何、組織培養(yǎng)常用的設(shè)備有哪些？各有何用途？用途？第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制第二節(jié)培養(yǎng)基及其配制

11、定義：定義： 培養(yǎng)基培養(yǎng)基(culture medium)(culture medium)根據(jù)植物生長所根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作人工制作的營養(yǎng)的營養(yǎng)物質(zhì)。是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)。是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)重要基質(zhì)。不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同不同植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官找到一合適的培養(yǎng)基，是培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。找到一合適的培養(yǎng)基，是培養(yǎng)成功的基

12、礎(chǔ)。一培養(yǎng)基成分一培養(yǎng)基成分主要為：主要為： 水水無機(jī)鹽無機(jī)鹽有機(jī)化合物有機(jī)化合物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)培養(yǎng)體的支持材料培養(yǎng)體的支持材料水水水是植物體的重要組成成分，是一切代謝過程水是植物體的重要組成成分，是一切代謝過程的的介質(zhì)和溶媒介質(zhì)和溶媒，是生命活動過程中不可缺少的，是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。物質(zhì)。培養(yǎng)基大部分是水（培養(yǎng)基大部分是水（固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 約約757580%80%）天然水或自來水天然水或自來水不能不能直接用于直接用于培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應(yīng)用應(yīng)用雙蒸水或超純水雙蒸水或超純水。大批量快速繁

13、殖培養(yǎng)，可用單蒸水或純凈水。大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用單蒸水或純凈水。 保持母液及培養(yǎng)基成保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性分的精確性防止貯藏過程發(fā)霉變防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)質(zhì)無機(jī)鹽類無機(jī)鹽類(inorganic element(inorganic element）離體組織生長發(fā)育的基本成分，根據(jù)離體組織生長發(fā)育的基本成分，根據(jù)植物對必需元素需要的量，可以分為：植物對必需元素需要的量，可以分為：大量元素大量元素微量元素微量元素大量元素大量元素指植物所需元素的濃度指植物所需元素的濃度大于大于0.5mmolL的元素，的元素，有有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除除C、H、O外，其它礦質(zhì)元素通常以一定

14、濃度的外，其它礦質(zhì)元素通常以一定濃度的無機(jī)化合物無機(jī)化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水形式，按一定比例配制而成，溶于水中以離子態(tài)被吸收中以離子態(tài)被吸收N有有硝態(tài)氮硝態(tài)氮KNO3和和銨態(tài)氮銨態(tài)氮(NH4)2SO4兩種形式（兩種形式（一一般般NH4NNH4N對植物生長較為有利對植物生長較為有利）。）。 微量元素微量元素 濃度小于濃度小于0.5mmol0.5mmolL L的元素，有的元素，有 FeFe、CuCu、ZnZn等。等。 鐵鹽在合成葉綠素中起重要作用，缺鐵影響鐵鹽在合成葉綠素中起重要作用，缺鐵影響到胚的發(fā)育，阻礙子葉變綠。到胚的發(fā)育，阻礙子葉變綠。3.3.有機(jī)化合物有機(jī)化合物(organ

15、ic compound) 基本基本培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（只含有大量和微量元素）只含有大量和微量元素） 為使培養(yǎng)物的生長更好，還需添加各種有機(jī)成分：為使培養(yǎng)物的生長更好，還需添加各種有機(jī)成分：糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等等（）糖類（碳水化合物（）糖類（碳水化合物 ）碳源，維持培養(yǎng)基的滲透壓在碳源，維持培養(yǎng)基的滲透壓在1.5-4.1MPa。多使。多使用用蔗糖蔗糖。 不同濃度會影響細(xì)胞的增殖分化，試管苗生長與繁殖濃度不同濃度會影響細(xì)胞的增殖分化，試管苗生長與繁殖濃度2-3%，幼胚，幼胚培養(yǎng)培養(yǎng)4-6%，某些特殊培養(yǎng)中用，某些特殊培養(yǎng)中用8-10%。 細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)

16、還用麥芽糖、葡萄糖、果糖細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)還用麥芽糖、葡萄糖、果糖（）維生素（）維生素明顯的明顯的促進(jìn)促進(jìn)離體培養(yǎng)物的離體培養(yǎng)物的生長生長。 鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素- -VB1VB1、鹽酸吡哆醇、鹽酸吡哆醇- -VB6VB6、煙酸、生物素、抗、煙酸、生物素、抗壞血酸壞血酸- -VcVc等。等。 一般用量為一般用量為0.10.11.0mg1.0mgL L。（）肌醇（）肌醇（環(huán)己六醇）（環(huán)己六醇）促進(jìn)促進(jìn)胚狀體和芽的形成胚狀體和芽的形成。用量一般。用量一般50-100mg/L50-100mg/L。（）氨基酸（）氨基酸常用甘氨酸和多種氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳常用甘氨酸和多種氨基酸混合物（水解酪

17、蛋白、水解乳蛋白）蛋白） 用量在用量在10-1000mg10-1000mgL L之間。之間。 （營養(yǎng)豐富，極易引起污染營養(yǎng)豐富，極易引起污染，如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。），如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。） （）（） 天然復(fù)合物（包括部分蛋白質(zhì)水解物）天然復(fù)合物（包括部分蛋白質(zhì)水解物）其其成分比較復(fù)雜成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。酶等一些復(fù)雜化合物。 對細(xì)胞和組織的對細(xì)胞和組織的增殖與分化增殖與分化有明顯的促進(jìn)有明顯的促進(jìn)作用，但對器官的分化作用不明顯。作用，但對器官的分化作用不明顯。 成分大多不清楚，一般盡量避免使用。成分大多不清楚，一

18、般盡量避免使用。 椰乳椰乳 使用最多、效果最大。用量為使用最多、效果最大。用量為10%20%（愈傷、細(xì)胞培養(yǎng)）。（愈傷、細(xì)胞培養(yǎng)）。 香蕉汁香蕉汁 用量為用量為150-200mlL，緩沖，緩沖pH值（蘭花組培）。值（蘭花組培）。 馬鈴薯馬鈴薯 用量為用量為150200gL，緩沖，緩沖pH值。值。 其他其他 酵母提取液、麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁等。遇熱較穩(wěn)酵母提取液、麥芽提取液、蘋果和番茄的果汁等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。定，大多在培養(yǎng)困難時使用，有時有效。 、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（植物激素）、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（植物激素） 植物激素（植物激素（hormonehormone）是植物新陳

19、代謝中）是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，能以產(chǎn)生的天然化合物，能以極微小的量極微小的量影響到影響到植物的細(xì)胞植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育分化、分裂、發(fā)育，影響到植物，影響到植物的的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老老和和休眠休眠以及以及萌發(fā)萌發(fā)等多種生理生化活動，是等多種生理生化活動，是培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)關(guān)鍵物質(zhì)。 主要包括：主要包括：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素生長素生長素0.05-5mgL細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素0.0510mgL。（）生長素類（）生長素類(auxin) u生長素主要被用于生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷誘導(dǎo)愈傷組織

20、形成，促進(jìn)細(xì)胞組織形成，促進(jìn)細(xì)胞脫脫分化分化，誘導(dǎo)根誘導(dǎo)根的分化和的分化和促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞細(xì)胞伸長伸長生長。生長。u天然天然的生長素的生長素?zé)岱€(wěn)定性差熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用用人工合成人工合成的生長素類物質(zhì)的生長素類物質(zhì)u常用常用IAAIAA、IBAIBA、NAANAA、2,4-D2,4-Du配成配成1mg/ml1mg/ml的溶液貯于冰箱中的溶液貯于冰箱中 IAA-IAA-天然生長素，亦可人工合成，其天然生長素，亦可人工合成，其活力較低活力較低，是生，是生長素中活

21、力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，受光也易分解溫高壓易被破壞，受光也易分解 NAA-NAA-啟動能力比啟動能力比IAAIAA高出高出3-43-4倍，可大批量人工合成，倍，可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，應(yīng)用較耐高溫高壓，不易被分解破壞，應(yīng)用較普遍普遍 IBA-IBA-促進(jìn)促進(jìn)發(fā)根發(fā)根能力較強(qiáng)能力較強(qiáng) NAANAA和和IBAIBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。芽的增殖和生長。 2 2，4 4D -D -啟動能力比啟動能力比IAAIAA高高1010倍，特別是倍，

22、特別是促進(jìn)愈傷促進(jìn)愈傷組組織的形成，同時強(qiáng)烈織的形成，同時強(qiáng)烈抑制芽抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)毒效應(yīng)腺嘌吟的衍生物，包括腺嘌吟的衍生物，包括6-BA6-BA、KtKt、Zt Zt 等。其中等。其中ZtZt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6-BA6-BA。作用：作用： 誘導(dǎo)誘導(dǎo)芽芽的分化的分化 促進(jìn)促進(jìn)側(cè)芽側(cè)芽萌發(fā)生長萌發(fā)生長 促進(jìn)細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大（莖增粗）分裂與擴(kuò)大（莖增粗），抑制根的分化，抑制根的分化，延緩衰老延緩衰老多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、芽的增殖。多用于誘導(dǎo)不定

23、芽的分化、芽的增殖。 （）細(xì)胞分裂素類（）細(xì)胞分裂素類(cytokinin(cytokinin，CTK)CTK)（）（）赤霉素赤霉素（gibberellic acid）n 有有2020多種，培養(yǎng)基中添加的是多種，培養(yǎng)基中添加的是GAGA3 3，一般極少使用一般極少使用n 作用作用n促進(jìn)幼苗促進(jìn)幼苗莖的伸長莖的伸長生長生長n促進(jìn)促進(jìn)胚發(fā)育胚發(fā)育成小植株；成小植株；n離體培養(yǎng)下，還與離體培養(yǎng)下，還與生長素生長素協(xié)調(diào)作用對協(xié)調(diào)作用對形成層分化形成層分化有影響有影響n當(dāng)當(dāng)生長素生長素赤霉素比值赤霉素比值高高，木質(zhì)部分化木質(zhì)部分化，比值低，韌皮部分化。，比值低，韌皮部分化。n打破休眠打破休眠，促進(jìn)種子、

24、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。n 在器官形成后，添加赤霉素在器官形成后，添加赤霉素有時有時可促進(jìn)器官或胚狀體可促進(jìn)器官或胚狀體的生長的生長激素配比模式激素配比模式 生長素生長素/ /細(xì)胞分裂素的比值決定分化發(fā)育的方向，細(xì)胞分裂素的比值決定分化發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。是愈傷組織、長根還是長芽。生長素生長素/ /細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素高高 利于根、愈傷組織的形成利于根、愈傷組織的形成適中適中 利于根芽的分化利于根芽的分化低低 有利于芽的形成有利于芽的形成 生長素與細(xì)胞分裂素同時使用有生長素與細(xì)胞分裂素同時使用有協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)作用。同時其在作用。同時其在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)

25、基中的絕對值絕對值也會影響外植體分化發(fā)育的方向。也會影響外植體分化發(fā)育的方向。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant.

26、No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No 6-BA 6-BA re

27、duced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roo

28、ts and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explantNAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced t

29、o 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.其它附加成分其它附加成分（）（）瓊脂瓊脂(agar) 是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。組織培養(yǎng)中最常用作凝本身并不提供任何營養(yǎng)。組織培養(yǎng)中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物，常用固劑，是最方便、最

30、好的凝固劑和支持物，常用量量6-10gL ，不是培養(yǎng)基必需成分。，不是培養(yǎng)基必需成分。（）活性炭（）活性炭(active carbon) 常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)，有利于培養(yǎng)物培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)，有利于培養(yǎng)物的生長。常用濃度的生長。常用濃度0.5%左右，其吸附作用選擇性左右，其吸附作用選擇性較差，常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸較差，常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。附能力降低甚至解吸附。 二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn)、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基種類

31、 根據(jù)作用分：根據(jù)作用分：誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：誘導(dǎo)外植體啟動生長。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)外植體啟動生長。增殖增殖培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗擴(kuò)大繁殖。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗擴(kuò)大繁殖。生根生根培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根。 根據(jù)營養(yǎng)水平分：根據(jù)營養(yǎng)水平分：基本基本培養(yǎng)基：包含無機(jī)鹽等基本營養(yǎng)成分。培養(yǎng)基：包含無機(jī)鹽等基本營養(yǎng)成分。完全完全培養(yǎng)基：包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。培養(yǎng)基：包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類16811681，出現(xiàn)由無機(jī)鹽組成的，出現(xiàn)由無機(jī)鹽組成的SacksSacks和和KnopKnop溶液溶液，至，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基今仍在作為基本的無機(jī)

32、鹽培養(yǎng)基4040年代多用年代多用WhiteWhite培養(yǎng)基培養(yǎng)基6060年代至今大多采用年代至今大多采用MSMS等高濃度培養(yǎng)基等高濃度培養(yǎng)基（可以保證培可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，由于濃度高，在配制、消毒過程中某養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要，由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡些成分有些出入，也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡） 培養(yǎng)基的名稱，多以發(fā)明人的名字來命名，也培養(yǎng)基的名稱，多以發(fā)明人的名字來命名，也有對某些成分進(jìn)行改良稱作有對某些成分進(jìn)行改良稱作改良改良培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 無機(jī)鹽和離子濃度較高，硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高。無機(jī)鹽和離子濃度較高

33、，硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高。 B B5 5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 含有較低的銨，雙子葉植物特別是木本植物許多都適于用含有較低的銨，雙子葉植物特別是木本植物許多都適于用B B5 5。 WhiteWhite培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19631963年又作了改良，稱作年又作了改良，稱作WhiteWhite改良培養(yǎng)基。無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較改良培養(yǎng)基。無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。低，適于生根培養(yǎng)。 N N6 6培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成分較簡單，成分較簡單，KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高。廣泛應(yīng)用于小麥、含量高。廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他

34、組織培養(yǎng)。 KMKM8P8P培養(yǎng)基培養(yǎng)基 有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 三、培養(yǎng)基的配制三、培養(yǎng)基的配制、母液的配制和保存、母液的配制和保存 母液是欲配制液的母液是欲配制液的濃縮液濃縮液 保證各物質(zhì)保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性成分的準(zhǔn)確性，減少微量元素用減少微量元素用藥稱量誤差藥稱量誤差 配制時能配制時能快速移取，快速移取，減少稱藥麻煩減少稱藥麻煩 便于低溫保藏。便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高一般母液配成比所需濃度高10-100倍。倍。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 濃度高耐貯存，但準(zhǔn)確度低；濃

35、度過低不耐貯濃度高耐貯存，但準(zhǔn)確度低；濃度過低不耐貯 避免不恰當(dāng)混合引起沉淀避免不恰當(dāng)混合引起沉淀 母液保存在母液保存在5 5冰箱中，出現(xiàn)沉淀、霉變的不能冰箱中，出現(xiàn)沉淀、霉變的不能使用使用 母液濃縮倍數(shù)母液濃縮倍數(shù)= =（稱取藥物的量（稱取藥物的量1000ml1000ml）/ /（每升培養(yǎng)基需藥物量（每升培養(yǎng)基需藥物量母液體積）母液體積）（）大量元素（）大量元素 可以混在一起配制成可以混在一起配制成10100倍倍液（常用液（常用5050倍）倍） 高濃度高濃度的的Ca2+和和Mg2+會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不會與磷酸鹽混合，產(chǎn)生不溶性沉淀，應(yīng)單獨(dú)配制溶性沉淀，應(yīng)單獨(dú)配制/ /或者單獨(dú)配制或者單獨(dú)配

36、制CaClCaCl2 2 也可也可（）微量元素（）微量元素可配成可配成50-1000倍（常用倍（常用100、200倍）倍）混合母液，混合母液，KI可單獨(dú)配。可單獨(dú)配。（）鐵鹽（）鐵鹽硫酸亞鐵硫酸亞鐵和和EDTA鈉鹽鈉鹽易沉淀，需單獨(dú)易沉淀，需單獨(dú)配制，配成配制，配成100200倍倍鰲合劑鰲合劑不易沉淀。不易沉淀。（）有機(jī)化合物（）有機(jī)化合物維生素、肌醇、氨基酸等一起配成維生素、肌醇、氨基酸等一起配成100100或或200200倍液，也可分別配制。倍液，也可分別配制。（）激素（）激素 每種單獨(dú)配成母液儲于冰箱，濃度一般為每種單獨(dú)配成母液儲于冰箱，濃度一般為0.51mg/ml。一般一次只配。一般一

37、次只配50ml或或100ml。 激素難溶于水，配制母液時用激素難溶于水，配制母液時用95%酒精酒精或或 1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。溶解后再定容。 生長素類用生長素類用NaOH、細(xì)胞分裂素用、細(xì)胞分裂素用HCl溶解溶解（6）有機(jī)附加物）有機(jī)附加物椰乳椰乳 液體胚乳（紗布液體胚乳（紗布濾渣濾渣）-80水浴濾液（水浴濾液（20分鐘）分鐘）-過濾過濾（去蛋白）（去蛋白）-高溫高壓滅菌高溫高壓滅菌-冰箱保冰箱保存存酵母提取液酵母提取液 酵母粉（加水煮沸酵母粉（加水煮沸30分鐘）分鐘）-過濾去渣過濾去渣-消毒消毒、培養(yǎng)基的配制及滅菌、培養(yǎng)基的配制及滅菌取適量蒸餾水放入容器將母液取出混合取適量蒸

38、餾水放入容器將母液取出混合將瓊脂和糖加入容器將瓊脂和糖加入容器蒸餾水定容至蒸餾水定容至所需體積所需體積調(diào)整調(diào)整p分裝培養(yǎng)瓶分裝培養(yǎng)瓶濕熱滅菌法，滅菌濕熱滅菌法，滅菌1520min某些遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)如某些遇熱不穩(wěn)定的物質(zhì)如IAA、ZT等進(jìn)行過（抽）等進(jìn)行過（抽）濾滅菌濾滅菌第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng)第三節(jié)外植體的選擇與培養(yǎng) 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的成敗除與培養(yǎng)基的組分有關(guān)外，另一個重要因素就是基的組分有關(guān)外，另一個重要因素就是外植體本身，為了使外植體適于在離體外植體本身，為了使外植體適于在離體培養(yǎng)條件下生長，使組織培養(yǎng)工作順利培養(yǎng)條件下生長，使組織培養(yǎng)工作順利進(jìn)行，有必要

39、對外植體進(jìn)行選擇與處理。進(jìn)行，有必要對外植體進(jìn)行選擇與處理。一、外植體的選擇一、外植體的選擇有有代表性代表性的主要植物的主要植物優(yōu)良優(yōu)良的種質(zhì)、的種質(zhì)、特殊特殊的基因型的基因型 在植株生長的最適時期取材（花藥培養(yǎng)在在植株生長的最適時期取材（花藥培養(yǎng)在單核期單核期取材）取材） 大小一般在大小一般在0.5-1.0cm0.5-1.0cm之間（胚胎培養(yǎng)或脫毒在之間（胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm0.5cm以下），材料太大易污染，材料太小難于成活。以下），材料太大易污染，材料太小難于成活。 從從生長健壯生長健壯的的無病蟲害無病蟲害的植株上選取的植株上選取發(fā)育正常發(fā)育正常的器官的器官和組織。和組織。最好采用莖

40、尖最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細(xì)菌，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細(xì)菌較少。較少。 二、外植體的滅菌二、外植體的滅菌外植體選取外植體選取 流水沖洗流水沖洗 （轉(zhuǎn)入超凈工作（轉(zhuǎn)入超凈工作臺）臺）70%酒精表面消毒酒精表面消毒2060s 無菌水沖洗無菌水沖洗 消毒劑消毒劑處理處理 無菌水充分洗凈備無菌水充分洗凈備用用三、外植體的接種（無菌操作）三、外植體的接種（無菌操作）外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。整個

41、過程均需無菌操作。（1 1）借助）借助接種用工具接種用工具將材料將材料切割切割分離。分離。（2 2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內(nèi)，）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內(nèi)，火焰灼燒培火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜斜角角，避免灰塵雜菌落入瓶中。，避免灰塵雜菌落入瓶中。（3 3）迅速將切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器）迅速將切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。（4 4）工具用后應(yīng)及時滅菌，避免）工具用后應(yīng)及時滅菌，避免交叉污染交叉污染。（5 5）工作人員操作時禁止不必要的談話。）工作人員操作時禁止不必要

42、的談話。四、外植體的培養(yǎng)四、外植體的培養(yǎng) 主要因素：主要因素：光照、溫度、濕度、氧氣光照、溫度、濕度、氧氣、光照、光照光照強(qiáng)度、光質(zhì)以及光照時間，對細(xì)胞光照強(qiáng)度、光質(zhì)以及光照時間，對細(xì)胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用要求外，一般都采用日光燈日光燈作光源，光照強(qiáng)作光源，光照強(qiáng)度度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物或器官需要，根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照可以每天連續(xù)光照12-16小時小時，也可每天光照，也可每天光照16小時，小時，8小時黑暗。小時黑暗。、溫度、溫度大所數(shù)植物最適溫度在大所數(shù)植物最適溫度在23-32之間。培

43、養(yǎng)之間。培養(yǎng)室溫度是室溫度是252。、濕度、濕度培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度常是培養(yǎng)瓶內(nèi)相對濕度常是100%，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持在在70-80%，相對濕度，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時地通風(fēng)除灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時地通風(fēng)除濕濕。、氧氣、氧氣接種時要有部分組織和空氣接觸。接種時要有部分組織和空氣接觸。振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生

44、長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細(xì)胞開始分裂。，有利于外植體外層細(xì)胞開始分裂。、 pH值值不同的植物對培養(yǎng)基最適不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的，值的要求也是不同的，大多在大多在56.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。需要。五、外植體的成苗途徑五、外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑有三種：外植體的成苗途徑有三種：（一）外植體（一）外植體- -愈傷組織愈傷組織- -完整植株完整植株 同時長芽和根同

45、時長芽和根- -植株植株 芽芽- -根根- -植株植株 根根- -芽芽- -植株植株（二）外植體（二）外植體- -胚狀體胚狀體- -植株植株a)a) 器官上器官上b)b) 愈傷組織愈傷組織c)c) 游離單細(xì)胞游離單細(xì)胞d)d) 小孢子小孢子 誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整（三）（三）外植體外植體- -直接形成根與芽直接形成根與芽- -植株植株六、培養(yǎng)中常見問題六、培養(yǎng)中常見問題（ 病原菌病原菌 ：細(xì)菌、真菌細(xì)菌、真菌細(xì)菌細(xì)菌污染：菌斑呈污染：菌斑呈黏液狀黏液狀，接種后，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。天發(fā)現(xiàn)。 污染途徑：外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹

46、底污染途徑：外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程操作人員未遵守操作規(guī)程 真菌真菌污染：污染部分長有不同顏色的污染：污染部分長有不同顏色的霉菌霉菌，接，接種后種后3-10天天發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)。 污染途徑：周圍環(huán)境不清潔；超凈工作臺過濾裝置污染途徑：周圍環(huán)境不清潔；超凈工作臺過濾裝置失效；培養(yǎng)瓶的口徑過大失效；培養(yǎng)瓶的口徑過大在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象2 2、污染的預(yù)防措施（、污染的預(yù)防措施（6 6點(diǎn)）點(diǎn)）（）防止材料帶菌的措施（）防止材料帶菌的措施 莖尖作外植體時，進(jìn)行莖尖作外植體時，進(jìn)行

47、預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)（無糖）或暗培（無糖）或暗培養(yǎng)，以養(yǎng)，以新抽嫩枝新抽嫩枝作外植體。作外植體。 晴天晴天取材，取材，下午下午取材，經(jīng)日曬可殺死部分細(xì)菌取材，經(jīng)日曬可殺死部分細(xì)菌或真菌或真菌 接種時除接種時除去外部韌皮去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組組織，只接內(nèi)部的分生組織。織。（2）外植體的滅菌）外植體的滅菌 多次多次滅菌法：次氯酸鈉滅菌法：次氯酸鈉- -無菌水無菌水- -次氯酸鈉次氯酸鈉 多藥劑多藥劑交替法：肥皂水交替法：肥皂水- -酒精酒精- -次氯酸鈉次氯酸鈉- -無菌水無菌水器皿與金屬器械的滅菌器皿與金屬器械的滅菌 玻璃器皿可采用濕熱滅菌或玻璃器皿可采用濕熱滅菌或滅菌滅菌 金屬器皿一般金屬器

48、皿一般火焰火焰滅菌，滅菌，也可干熱滅菌也可干熱滅菌（135-140135-140攝氏攝氏度滅菌度滅菌3-5h3-5h；160-170160-170攝氏度滅菌攝氏度滅菌2-4h2-4h；180180-200-200攝氏度攝氏度滅菌滅菌0.5-0.5-1h1h）布質(zhì)制品的滅菌布質(zhì)制品的滅菌 濕熱滅菌濕熱滅菌無菌操作室的滅菌無菌操作室的滅菌 2%新潔爾滅或新潔爾滅或70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。嚴(yán)格按照無菌操作程序進(jìn)行嚴(yán)格按照無菌操作程序進(jìn)行在干燥環(huán)境（如在干燥環(huán)境（如火焰或干熱空氣）火焰或干熱空氣）進(jìn)行滅菌的技術(shù)進(jìn)

49、行滅菌的技術(shù)a.a. 基因型基因型b.b. 外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài)幼年的材料、分生組織含醌類物質(zhì)較少幼年的材料、分生組織含醌類物質(zhì)較少c.c. 培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 無機(jī)鹽濃度過高無機(jī)鹽濃度過高 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，BABA過多過多 培養(yǎng)條件不適宜，培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強(qiáng)溫度過高或光照過強(qiáng)d.d. 材料轉(zhuǎn)移時間材料轉(zhuǎn)移時間時間過長引起材料褐變時間過長引起材料褐變外植體體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞外植體體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)的酚類酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類醌類物質(zhì)，物質(zhì)，這種致死的褐變物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐這種致

50、死的褐變物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。1、影響因素、影響因素選擇選擇適宜的外植體適宜的外植體及及最佳培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)基提高提高轉(zhuǎn)管轉(zhuǎn)管率率加加抗氧化劑抗氧化劑（抗壞血酸、（抗壞血酸、PVP、牛血清白、牛血清白蛋白等）蛋白等）加加活性炭活性炭 0.1-0.5%活性炭活性炭 2、褐變的防止措施、褐變的防止措施l組培苗外觀形態(tài)呈組培苗外觀形態(tài)呈 半透明狀的生長異常現(xiàn)象半透明狀的生長異常現(xiàn)象l葉、嫩梢呈水晶透明或半透明葉、嫩梢呈水晶透明或半透明水浸狀水浸狀；矮小；矮小腫脹失腫脹

51、失綠綠；葉片皺縮卷曲、；葉片皺縮卷曲、脆弱易碎脆弱易碎l葉表幾葉表幾無角質(zhì)層無角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織欄組織，僅有海綿組織l體內(nèi)體內(nèi)含水量高含水量高，干物質(zhì)低，干物質(zhì)低，光合能力和酶活性降低光合能力和酶活性降低，組織畸形組織畸形，器官功能不全器官功能不全，分化能力降低，分化能力降低l生根困難生根困難，很難繼續(xù)培養(yǎng)和移栽成活，很難繼續(xù)培養(yǎng)和移栽成活激素激素：CTKCTK濃度、比例過高（繼代次數(shù)太多）濃度、比例過高（繼代次數(shù)太多）瓊脂瓊脂：瓊脂濃度低（培養(yǎng)基太：瓊脂濃度低（培養(yǎng)基太“稀稀”）溫度溫度：低溫：低溫光照光照時間：光照太多、太

52、強(qiáng)時間：光照太多、太強(qiáng)通風(fēng)通風(fēng)條件：氣體交換不良條件：氣體交換不良(6)離子離子水平：無機(jī)離子種類及比例不當(dāng)水平：無機(jī)離子種類及比例不當(dāng) 提高蔗糖和瓊脂濃度（提高提高蔗糖和瓊脂濃度（提高滲透勢滲透勢） 適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例 適當(dāng)增加適當(dāng)增加Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu，降低，降低NN（銨態(tài)氮銨態(tài)氮）和）和ClCl（重選或改良培養(yǎng)基配方重選或改良培養(yǎng)基配方） 增加增加自然光照，自然光照，1000-1800lx，控制光照時間，控制光照時間8-12h。 適溫適溫生長，熱擊處理生長，熱擊處理 使用透氣性好的封口膜使用透氣性

53、好的封口膜 培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入青霉素青霉素、間苯三酚間苯三酚、根皮苷根皮苷或或多效唑多效唑等等一、試管苗的特點(diǎn)一、試管苗的特點(diǎn)1 1、試管苗的生態(tài)環(huán)境、試管苗的生態(tài)環(huán)境高、恒溫高、恒溫 試管苗整個生長過程中采用的是試管苗整個生長過程中采用的是恒溫培養(yǎng)，溫差很小恒溫培養(yǎng)，溫差很小。并且溫度一般控制在并且溫度一般控制在25+2甚至更高。甚至更高。 外界環(huán)境條件外界環(huán)境條件溫度不斷變化溫度不斷變化，其調(diào)節(jié)由太陽輻射決定，其調(diào)節(jié)由太陽輻射決定，溫差很大（季節(jié)、日夜）溫差很大（季節(jié)、日夜），而且一般不會達(dá)到，而且一般不會達(dá)到25+2。 組織培養(yǎng)出來的苗通組織培養(yǎng)出來的苗通稱試管苗或組培苗稱試管苗或組培苗高濕高濕 試管瓶內(nèi)水分移動途徑有兩條：試管瓶內(nèi)水分移動途徑有兩條：試管苗水分從氣孔蒸騰試管苗水分從氣孔蒸騰培養(yǎng)基向外蒸發(fā)，凝結(jié)后又進(jìn)入培養(yǎng)基培養(yǎng)基向外蒸發(fā)，凝結(jié)后又進(jìn)入培養(yǎng)基