1、成人繼續教育學院學生（ 科）畢業論文（科研初步訓練論文）論文題目 H2株病毒接種量與收獲量的 相關性研究 學院、專業生命科學學院 生物科學年 級 2010 學生姓名 岳 俊 指導教師 職稱 學 號 107830005 二零一四年十月十五日內容提要：云 南 師 范 大 學畢業設計（論文）H2株病毒接種量與收獲量的相關性研究年 級: 2010 學 號: 107830005 姓 名: 岳 俊 專 業: 生物科學 指導老師: 二零一四年十月摘 要 本文采用酶聯免疫吸附試驗1（雙抗體夾心ELISA）檢測在人胚肺二倍體細胞KMB17細胞上（以下簡稱“KMB17細胞”）以不同MOI接種甲型肝炎病毒H2減毒株

2、后得到的病毒收獲液，研究MOI與收獲液效價之間的關系。通過對5個試驗批收獲液的檢測數據研究表明：MOI與收獲液效價之間沒有明確的關系。經分析發現：1. H2株接種后隨著細胞的分裂而不斷增殖并釋放少量抗原至培養液中繼而進入新的細胞繼續增殖。2.感染性滴度的檢測：一方面毒種需要進行10倍系列稀釋至-8，要求精度較高，另一方面酶聯免疫吸附試驗操作步驟較多容易造成誤差。關鍵詞：MOI； 感染性滴度； 抗原檢測；AbstractIn this paper, using enzyme-linked immunosorbent assay 1 (double antibody sandwich ELISA)

3、 detection in human embryo lung diploid cell KMB17 cells (hereinafter referred to as the KMB17 cells) with MOI of different inoculation of hepatitis A virus H2 attenuated virus liquid obtained after harvest,To study the relationship between MOI and harvest liquid titer. Through the show on the 5 tes

4、t batch of harvested liquid detection data research: there is no clear relationship between MOI and harvested liquid titer. The analysis found that: 1.H2 strain after inoculation with cell division and proliferation and continue to release a small amount of antigen into the liquid culture medium and

5、 then enter the new cells continue to proliferate. 2. Detection of infectious titers of virus: hand needs to be 10 fold serial dilution to -8, requiring high precision, on the other hand, enzyme linked immunosorbent assay steps more easy to cause the error.Keywords: MOI; infective titer; antigen det

6、ection;目錄本論文的背景和意義5本論文的主要方法和研究進展5KMB17細胞擴增5H2株病毒接種5病毒收獲6抗原檢測6感染性滴度檢測7酶聯免疫吸附試驗（雙抗體夾心ELISA）8滴度尾數查算表8結 論9致謝10參考文獻11附錄1 KMB17細胞株12附錄2 H2株131 本論文的背景和意義現今疫苗已經成為疾病預防的主要手段，降低疫苗的生產成本不僅有利于大規模的推廣使用疫苗消滅疾病，還能使疫苗生產企業減少物資的投入，節約資源。在此就中國醫學科學院醫學生物學研究所（以下簡稱“生物所”）生產的凍干甲型肝炎減毒活疫苗生產過程中甲型肝炎病毒H2減毒株（以下簡稱H2株）接種MOI與病毒收獲量的相關性進行

7、初步試驗研究。生物所從事多年的凍干甲型肝炎減毒活疫苗的生產，病毒收獲階段的效價檢測結果有的批次效價高，有的批次效價低，效價高的批次可以更大倍數稀釋病毒原液后進行分裝。相同的培養條件下為什么各批次間的效價會有明顯差異。本論文通過不同MOI接種病毒，經培養后收獲病毒原液。用酶標分析儀檢測不同MOI所收獲的病毒收獲液的效價和感染性滴度，以找到生產出高效價病毒原液的最適MOI。意義：生產高效價病毒原液，減少原材料的耗費和人力物力的投入，大幅降低生產成本。2 本論文的主要方法和研究進展2.1 KMB17細胞擴增 從細胞庫領取工作種子在37恒溫室進行培養，每隔四天按1：2比例進行細胞傳代擴增8個細胞工廠。

8、2.2 H2株病毒接種 領取10代H2株工作毒種經超聲破碎后按“表1 H2株病毒接種量與檢測結果匯總表”所示MOI和五個試驗批的細胞懸液進行病毒吸附后分按1:4比例分種,培養溫度為35。H2株工作毒種抗原含量為107.67/ml，MOI為病毒感染復數MOI=病毒數/細胞數。為了保證批間差異最小化，細胞懸浮液經混合均勻后分成五個批次再下表MOI加入病毒進行吸附。表1 H2株病毒接種量與檢測結果匯總表Table 1 H2 strains of the virus inoculum and detection results summary批號培養面積細胞總量MOI毒種加量ml抗原檢測感染性滴度S1

9、6*10*632cm215億0.288.910247.50S26*10*632cm215億0.319.910247.34S36*10*632cm215億0.5016.010248.33S46*10*632cm215億1.0032.110247.50S56*10*632cm215億1.5048.110247.502.3 病毒收獲 從病毒接種之日起9-12天更換細胞維持液，22-26天按四倍濃縮（5ul/cm2）進行病毒收獲并做無菌檢查。2.4 抗原檢測各批病毒收獲液經超聲破碎細胞后取樣倍比稀釋至如下表“表2 抗原檢測上樣計劃表”所示并復孔上樣至酶聯免疫吸附法檢測試劑(盒) 2，設置陰性對照、標準

10、品參考。使用酶標分析儀4檢測OD值。檢測結果如下表“表3 抗原檢測OD值”。Cut off=陰性對照平均值*2.1 =0.236，OD值大于0.236的為陽性，小于0.236則為陰性。結果顯示不同MOI種毒收獲液抗原檢測均為1024（效價相同）。表2 抗原檢測上樣計劃表 Table 2 antigen detection sample schedule123456789101112AS1-32S1-32S2-32S2-32S3-32S3-32S4-32S4-32S5-32S5-32陰性對照BS1-64S1-64S2-64S2-64S3-64S3-64S4-64S4-64S5-64S5-64陰性

11、對照CS1-128S1-128S2-128S2-128S3-128S3-128S4-128S4-128S5-128S5-128陰性對照DS1-256S1-256S2-256S2-256S3-256S3-256S4-256S4-256S5-256S5-256標準128ES1-512S1-512S2-512S2-512S3-512S3-512S4-512S4-512S5-512S5-512標準128FS1-1024S1-1024S2-1024S2-1024S3-1024S3-1024S4-1024S4-1024S5-1024S5-1024標準128GS1-2048S1-2048S2-2048S2-

12、2048S3-2048S3-2048S4-2048S4-2048S5-2048S5-2048空白H 表3 抗原檢測OD值 Table 3 antigen detection OD123456789101112A3.6733.5493.5063.3483.7223.8263.5083.6023.4613.3520.134 B3.2143.1082.8172.6433.5513.4313.2803.1753.3263.2490.107 C1.6591.7621.3761.4821.5971.5521.7141.6291.5721.5380.096 D0.8370.9150.6980.7540.83

13、90.7090.9260.8910.8330.8270.362 E0.5240.6070.5330.4190.4030.4790.5810.6270.4980.5040.347 F0.294 0.315 0.349 0.308 0.382 0.297 0.317 0.448 0.372 0.356 0.351 G0.115 0.109 0.142 0.137 0.108 0.116 0.1210.150 0.132 0.140 0.027H注：Cut off=(0.134+0.107+0.096)/3*2.1=0.2362.5 感染性滴度檢測從各批病毒收獲液中取樣1ml分別做10倍梯度稀釋至-

14、8，選擇-5 -6 -7 -8四個稀釋度，各稀釋度接種事先傳代好的5個T25小方瓶（每個小方瓶加入1ml病毒稀釋液），培養至24天進行病毒收獲（每8天需更換細胞維持液）。對收獲液進行超聲破碎后按下表“表4 感染性滴度檢測上樣計劃表”上樣至酶聯免疫吸附法檢測試劑(盒) 2后使用酶標分析儀4檢測OD值。檢測結果如下表“表5 感染性滴度檢測OD值”。Cut off=陰性對照平均值*2.1 =0.257，OD值大于0.257的為陽性，小于0.257則為陰性。結果按“表6 滴度尾數查算表”查找各批滴度并統計到“表1 H2株病毒接種量與檢測結果匯總表”，結果顯示不同MOI種毒得到的收獲液感染性滴度之間沒有

15、明確的關系。表4 感染性滴度檢測上樣計劃表Table 4 infective titer detection sample schedule123456789101112AS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6對照細胞BS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6對照細胞CS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6對照細胞DS1-8S1-6S2-8S2-6S3-8S3-6S4-8S4-6S5-8S5-6陽性對照ES1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5

16、-7S5-5陽性對照FS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5陰性對照GS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5陰性對照HS1-7S1-5S2-7S2-5S3-7S3-5S4-7S4-5S5-7S5-5空白表5 感染性滴度檢測OD值 Table 5 Infectious titer detection OD123456789101112A0.147 3.408 3.257 3.560 0.185 3.362 3.209 3.229 0.108 3.358 0.131 B0.138 3.244 0.115 3.438

17、 3.465 3.518 3.4263.215 0.109 3.391 0.127 C3.52 3.350 0.150 3.591 3.505 3.266 0.133 3.341 3.509 3.287 0.109 D3.4163.445 0.162 0.150 3.524 3.379 0.155 3.338 0.108 3.419 2.175 E3.364 3.219 3.419 3.640 3.511 3.545 0.137 3.513 0.197 3.639 2.230 F0.1573.484 0.168 3.672 3.617 3.622 0.129 3.554 3.448 3.495

18、 0.097 G0.120 3.558 3.382 3.451 3.459 3.471 3.263 3.481 3.520 3.548 0.101 H3.544 3.322 3.408 3.562 3.480 3.515 3.392 3.470 3.285 3.509 0.036 注：Cut off=(0.131+0.127+0.109)/3*2.1=0.2572.6 酶聯免疫吸附試驗1（雙抗體夾心ELISA）加待檢抗原 37 120分鐘 形成固相抗體-抗原復合物，洗滌五次、拋干加酶標抗體 37 60分鐘 形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，洗滌五次、拋干加底物液 37 15分鐘顯色加終止液用

19、酶標分析儀測定OD值檢測結果輸出至excel表格2.7滴度尾數查算表5（表6 滴度尾數查算表）查找方法：找到與病變細胞管數相符橫列*數字之所在，該稀釋度即為 Log10TCID50之整數，加上該橫列之尾數，即為Log10TCID50。如 10-5稀釋度有4管病變，10-6及10-7各有一管病變，找到左首第三橫列即：Log10TCID50為5.83。表6 滴度尾數查算表 Table 6 titer mantissa look-up table各稀釋度病變管數尾數各稀釋度病變管數尾數4 *0000.543 *00.334 *100.6743 *10.504 *110.8343 *11.5041 *

20、11.0043 *20.7742 *00.00432 *1.0042 *10.23432 *2.2542 *11.44433 *0.1742 *20.50433 *1.3442 *21.75433 *2.56422 *2.004333 *.00結 論五個試驗批的抗原檢測和感染性滴度檢測數據顯示MOI從0.28至1.5之間各批抗原檢測無差異、感染性滴度檢測中只有S3批達到8.33，其余均在之間，感染性滴度檢測不隨MOI增加而增加，而是呈拋物線形狀。結論：MOI和抗原含量、感染性滴度之間無明確關系。H2株培養周期較長，因H2株在KMB17細胞上接種后隨著細胞的分裂不斷增殖并釋放少量抗原至培養液中繼

21、而進入新的細胞中繼續增殖，所以即使MOI較低也能使大部分KMB17細胞感染H2株，所以不同MOI得到的收獲液抗原檢測都一致。感染性滴度的檢測一方面需要對毒種進行10倍系列稀釋至-8，且培養周期比較長（24天），另一方面酶聯免疫吸附試驗操作步驟較多、要求精度較高容易造成誤差。從五個批次抗原檢測和感染性滴度檢測結果來看可以使用更低的MOI來進行病毒接種。表1 H2株病毒接種量與檢測結果匯總表Table 1 H2 strains of the virus inoculum and detection results summary批號培養面積細胞總量MOI毒種加量ml抗原檢測感染性滴度S16*10*

22、632cm215億0.288.910247.50S26*10*632cm215億0.319.910247.34S36*10*632cm215億0.5016.010248.33S46*10*632cm215億1.0032.110247.50S56*10*632cm215億1.5048.110247.50致 謝生物制品二室生物制品四室質量檢定室參考文獻1GB/T14926.50-2001實驗動物酶聯免疫吸附試驗2 YY/T 1183-2010酶聯免疫吸附法檢測試劑(盒)3邢玉蘭 黃雪卿 周紹蓮 酶聯免疫吸附驗試抗-HAV IgM試劑盒的研制與應用生物工程進展 1986年03期: 55-564 JJG 861-2007 酶標分析