1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對失血性休克大鼠早期炎性反應(yīng)的影響作者：李彤 王子薇 王淑梅 張學(xué)軍 李艷秋單位：吉林大學(xué)口腔醫(yī)院通訊作者：王淑梅 單位：吉林大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科基金項(xiàng)目：吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目 吉發(fā)改高技【2013】779號【摘要】 目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對失血性休克大鼠血清炎性因子及重要臟器的影響。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組（n=20）。改良Wiggers法制備大鼠出血性休克模型，休克持續(xù)90 min。治療組在復(fù)蘇前給予106個(gè)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PBS懸液1ml，假手術(shù)組和模型組給予相同體積PBS溶液。分別于復(fù)蘇后6h、

2、12h、24h、48h、72h取血清，ELISA檢測TNF-，IL-1、IL-6、IL-10水平，HE染色觀察心、肝、肺、腎病理損傷。結(jié)果 治療組血清TNF-和IL-6在復(fù)蘇后12h-72h內(nèi)較模型組顯著下降（p0.05）；治療組血清IL-1在復(fù)蘇后6h-12h內(nèi)較模型組下降顯著（p0.05）；治療組IL-10水平在復(fù)蘇后6h-48h內(nèi)均較模型組有顯著升高（p0.05）。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減輕肺、肝、腎、心等器官的炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能調(diào)節(jié)失血性休克早期重要炎性因子水平，促進(jìn)機(jī)體促炎-抗炎系統(tǒng)平衡。【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；失血性休克；炎癥因子；免疫調(diào)節(jié)The effects

3、 of BMSCs on early inflammatory response in hemorrhagic shock rats Xie Chong, He Jian-bin, Yu Qian, Xing Bai-chun, Yu Dai-hua, Yao Li-nong. Department of Anesthesiology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710038, China【Abstract】 Objective The purpose of this study was to i

4、nvestigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on serum levels of early inflammatory cytokines and major organ damage after hemorrhagic shock in rat. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and treatment group (n = 20). 106 BMSCs of the

5、 third passage were infused in treatment group before resuscitation. The other 2 groups were given PBS. Serum levels of TNF-, IL-1, IL-6, IL-10 were detected by ELISA at 6h, 12h, 24h, 48h, 72h after resuscitation. Heart, liver, lung, kidney were observed by HE staining. Results compared with model g

6、roup, serum levels of TNF- and IL-6 in treatment group significantly reduced between 12h-72h after resuscitation (P0.05); serum levels of IL-1 decreased significantly between 6h-12h. (P0.05), the level of IL-10 in treatment group increased within 6h-48h after resuscitation compared with that of mode

7、l group (P0.05). BMSCs decreased the inflammation induced by hemorrhagic shock in lung, liver, kidney and heart. Conclusions BMSCs can play an important role on inmune regulation at early inflammatory response after resuscitation of hemorrhagic shock and promotes the balance of pro-inflammation and

8、anti-inflammation in rat. Key words：Bone mesenchymal stem cells；Hemorrhagic shock；Inflammatory factors；Immunoregulation失血性休克由于組織有效灌流不足、細(xì)胞代謝紊亂以及菌群移位產(chǎn)生大量炎性因子，導(dǎo)致機(jī)體抗炎-促炎自穩(wěn)態(tài)失衡，促炎因子大量釋放，最終可演變?yōu)槿硌仔苑磻?yīng)綜合癥（SIRS），成為全身多器官功能不全綜合癥（MODF）的發(fā)病基礎(chǔ)，后者是導(dǎo)致機(jī)體死亡的最主要原因1。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極低的免疫原性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能2，在多種組織損傷和修復(fù)中表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)能力，但對

9、失血性休克后免疫失衡的影響尚未研究。本研究利用培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠失血性休克模型，調(diào)查間充質(zhì)干細(xì)胞對炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的影響，以證實(shí)其減輕失血性休克后炎性反應(yīng)的效果，從而探討失血性休克臨床救治的新思路。材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD大鼠，質(zhì)量250300g。購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會批準(zhǔn)。主要試劑 DMEM-LG培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PE anti-rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106（美國Biolegent公司）；戊巴比妥鈉（第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心）；大鼠TNF-

10、 ELISA試劑盒、IL-1 ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒（美國RDD公司）；鏈霉素、氨芐青霉素（華北制藥有限公司）。主要儀器 CO2恒溫孵育箱（美國Thermo公司）；液閃計(jì)數(shù)儀 （美國Beckman公司）；IMT-2型倒置生物學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-4型恒溫水浴箱(金壇富華電器有限公司)；流式細(xì)胞儀 （美國BD FACSAriaTM）；高速調(diào)溫離心機(jī)（美國Sigma公司）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定 大鼠頸椎脫臼處死，取雙后肢脛骨和股骨。無菌2ml注射器吸取培養(yǎng)基迅速反復(fù)沖洗骨髓腔多次，直至沖出大部分骨髓。加入

11、含10%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)基，無菌玻璃管反復(fù)吹打，直至細(xì)胞充分重懸于培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞濃度至1106/cm2,接種細(xì)胞于75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，37,5% CO2孵箱培養(yǎng)、傳代。取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗后棄去，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞皺縮變圓并部分脫落時(shí)加入胎牛血清終止消化，反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞至絕大部分脫落，制成細(xì)胞懸液。離心取上清，PBS溶液調(diào)整細(xì)胞濃度至1107/ml。加入PE 抗鼠 CD29、PE 抗鼠CD34、PE 抗鼠CD45、PE 抗鼠CD90、PE 抗鼠 CD106。避光，4C冰箱內(nèi)孵育30min。將制備好的樣品行流式細(xì)胞儀鑒定，Cell

12、quest軟件分析數(shù)據(jù)。大鼠失血性休克模型 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定。分離左股動(dòng)脈插管，按3mg/kg體重輸注肝素鈉溶液，連接心電監(jiān)護(hù)儀持續(xù)監(jiān)測平均動(dòng)脈壓MAP。分離右股動(dòng)脈，插管連接無菌注射器。急性快速放血至MAP降至40mmHg，而后間斷放血或回輸失血維持MAP在30-40mmHg水平90min。90min后回輸全部失血進(jìn)行復(fù)蘇。實(shí)驗(yàn)分組 假手術(shù)組（A組）：大鼠麻醉后固定，分離左右股動(dòng)脈插管，不失血，不輸注任何溶液，90min后拔管結(jié)扎血管后縫合切口。（2）失血性休克模型組（B組）：大鼠麻醉固定，分離左右股動(dòng)脈插管，均造失血性休克模型，90min后回輸全部失血（5-6min回輸1ml失

13、血），之后輸注PBS溶液1ml，結(jié)扎血管，縫合切口。（3）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組（C組）：失血 90min后回輸全部失血（5-6min回輸1ml失血），之后輸注含有106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PBS溶液1ml，結(jié)扎血管，縫合切口。各組于復(fù)蘇后6h、12h、24h、48h、72h 4只大鼠取樣本待檢。血清TNF-、IL-1、IL-6、IL-10的ELISA測定 分別于復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)取大鼠下腔靜脈血，離心取上清，-80C冷凍保存?zhèn)錂z。檢測按照ELISA說明書步驟進(jìn)行。各組大鼠重要臟器的HE染色 各組大鼠處死后，取下心、肝、肺、腎臟，PBS沖洗后4%甲醛固定。24h以上。高濃度酒精脫水，浸蠟包埋。蠟塊

14、切片5-8m。二甲苯脫蠟，酒精伊紅染色液染色2-3min。純酒精脫水后二甲苯透明。加拿大樹膠封固、觀察。統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)。結(jié) 果大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代 將骨髓內(nèi)細(xì)胞離心重懸后接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶后，倒置顯微鏡下可見大量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。12h即見部分細(xì)胞貼壁，呈大小不等圓形，并開始繁殖。48h-72h后可見不規(guī)則形、三角形，并伴有小突起。8-10天后，細(xì)胞大多呈梭形，突起明顯，排列呈旋渦狀。當(dāng)傳代至第3代時(shí)，紡錘形和梭形細(xì)胞增多明顯，呈典型的成纖維樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)，生長

15、均勻，形態(tài)趨向一致。流式細(xì)胞儀將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物檢測，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表明高表達(dá)CD29、CD90、CD106、CD44，低表達(dá)CD34、CD45，表達(dá)率分別98.4%、99.6%、50.2%、17.2%、1.5%、4.7%（圖1）各組大鼠血清炎性因子濃度變化 休克復(fù)蘇后相對于假手術(shù)組，模型組的TNF-、IL-1、IL-6濃度顯著上升（P0.05），而治療組TNF-、IL-1、IL-6濃度在各時(shí)間點(diǎn)均比模型組明顯下降（P0.05）。模型組IL-10的濃度較假手術(shù)組顯著下降（P0.05）；6h-48h內(nèi)，治療組IL-10的濃度均比模型組升高（P0.05）（圖2）。臟器染色觀察

16、 模型組肺組織正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁明顯增寬，肺泡腔含氣量減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤。輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞則炎細(xì)胞浸潤減少，肺組織結(jié)構(gòu)相對完整。休克后大鼠肝臟結(jié)構(gòu)排列紊亂，肝細(xì)胞有空泡樣變性，胞質(zhì)呈疏松樣改變，匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇72h后，肝結(jié)構(gòu)排列正常，炎性細(xì)胞浸潤減少。休克后腎間質(zhì)有少量瘀血，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎正常結(jié)構(gòu)造破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后72h可見病損區(qū)新的毛細(xì)血管再生，炎細(xì)胞浸潤減少。模型組心肌細(xì)胞渾濁腫脹，間質(zhì)水腫，橫紋不規(guī)則，胞核完整或稍大，炎性細(xì)胞浸潤。輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞72h后，

17、心肌排列整齊，炎性細(xì)胞減少，胞核完整。討 論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中的一種具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干細(xì)胞，具有兩個(gè)重要的生物學(xué)特征3-5：一是在特定條件下向軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞分化的能力，對損傷組織有顯著修復(fù)作用；二是獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性和極低的免疫原性。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過多種免疫抑制介質(zhì)進(jìn)行多靶位、多途徑的免疫調(diào)節(jié)、控制炎性反應(yīng)。對組織缺血再灌注損傷具有良好的修復(fù)功能和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)平衡的能力。出血性休克復(fù)蘇后免疫功能紊亂是全身炎性反應(yīng)綜合征的發(fā)病基礎(chǔ)，表現(xiàn)為過度的促炎反應(yīng)和明顯抑制的抗炎反應(yīng)6。目前的各種治療和預(yù)防措施效果有限。本

18、實(shí)驗(yàn)中復(fù)蘇時(shí)給予106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠顯著抑制血清中炎性因子TNF-、IL-1、IL-6的水平并增高血清抗炎因子IL-10的水平，并減輕肺、肝、腎、心等重要器官的炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)新生血管的再生，修復(fù)受損組織，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的平衡。研究表明，CD4+CD25+ Tregs細(xì)胞7是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要的效應(yīng)細(xì)胞。CD4+CD25+ Tregs細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)能力、控制免疫病理損傷的T細(xì)胞群，主要來源于CD4+CD8-細(xì)胞，特征是8-10能表達(dá)某種或某些細(xì)胞表面分子與靶細(xì)胞表面受體相互作用，使靶細(xì)胞休止于細(xì)胞周期G0/G1期而停止增殖，從而介導(dǎo)免疫抑制作用。CD4

19、+CD25+ Tregs細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物Foxp3是自身免疫的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，直接控制各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其基因表達(dá)產(chǎn)物Scurfin蛋白是一種轉(zhuǎn)錄的阻遏物，可結(jié)合至細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)區(qū)，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)量，而缺乏Scurfin可引起迅速的淋巴細(xì)胞增生性疾病，對免疫環(huán)境的自我穩(wěn)定十分重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對CD4+CD25+ Tregs細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能是其在出血性休克復(fù)蘇后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的主要途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對出血性休克的免疫調(diào)節(jié)提供了新方法，但仍有許多問題需要解決，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外如何鑒定、大量擴(kuò)增、保存？輸注的干細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢、分化情況？是否誘導(dǎo)感染和腫瘤？如何調(diào)節(jié)Treg

20、s細(xì)胞的發(fā)育和功能？隨著對休克病理機(jī)制更加深入的研究、對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞認(rèn)識的不斷增多，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞將有可能用于臨床出血性休克的救治。圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定圖2 各組大鼠血清炎性因子濃度變化（* 與模型組比較P0.05） 參考文獻(xiàn)1 劉良明，胡沛紅嚴(yán)重創(chuàng)傷休克的液體復(fù)蘇新進(jìn)展J中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2003，15(5)：314-316.2 Pittenger MF, Martin BJ: Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95:920, 2004.3 Da,

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