1、類藥材炙珠的代表性應(yīng)用。這種可靠的、低成本、高效、環(huán)保的炮制膠珠的方法也可在其他中藥膠材中推廣應(yīng)用。參考文獻:1張保國1阿膠的現(xiàn)代炮制研究J1河南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2003,2(2:12412中國藥典S1一部1200513李光甫,任玉珍1中藥炮制工程學(xué)M1北京:化學(xué)工業(yè)出版社,200714樊繪曾,劉或曦1阿膠蛋白質(zhì)定量方法的比較J1中國中藥雜志,1994,19(4:2241六味地黃丸的HPLC指紋圖譜和模式識別研究趙洪芝1,2,孟憲生33,葉挺祥1,2,劉征輝1,2,程奕1,2,羅國安3(11天津海世達檢測技術(shù)有限公司,天津300381;21天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗中心,天津300381;3

2、1清華大學(xué)化學(xué)系,北京100084摘要:目的研究六味地黃丸的質(zhì)量控制方法。方法采用高效液相色譜法,色譜柱為Agilent Z orbax SB C18 (250mm×416mm,5m,乙腈2水梯度洗脫,柱溫:30,體積流量:110mL/min,檢測波長為236nm,并利用聚類分析法和主成分分析法分析結(jié)果。結(jié)果通過聚類分析將不同廠家和批次的25個樣品分為3類,不同劑型的六味地黃制劑HPL C指紋圖譜存在明顯的差異。主成分分析分類結(jié)果與聚類分析分類結(jié)果一致,經(jīng)主成分分析,8個共有峰可綜合為3個主成分,其累積貢獻率達821844%,馬錢苷的相對峰面積為六味地黃丸指紋圖譜中影響比較大的指標(biāo)。

3、結(jié)論此方法可較系統(tǒng)地用于六味地黃丸的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞:六味地黃丸;指紋圖譜;模式識別中圖分類號:R28412;R286102文獻標(biāo)識碼:A文章編號:0253-2670(201001-0048-04HPLC Fingerprint and chemical pattern recognition of Liuw ei Dihu ang PillsZHAO Hong2zhi1,2,M EN G Xian2sheng3,YE Ting2xiang1,2,L IU Zheng2hui1,2,C H EN G Y i1,2,L UO Guo2an3(11Tianjin High2standard Qua

4、lity Testing Laboratary,Tianjin300381,China;21Tianjin Center for Quality Testing of TCM,Tianjin300381,China;31Department of Chemistry,Tsinghua University,Beijing100084,China Abstract:ObjectiveTo establish a met hod for t he quality control of Liuwei Dihuang Pills1Methods H PL C Met hod was developed

5、 to establish t he fingerp rint of Liuwei Dihuang Pills1The separation was per2 formed on Agilent Zorbax SB C18(250mm×416mm,5mcolumn gradient eluted wit h t he mobile p hase consisting acetonit rile and water at t he flow rate of110mL/min1The detection wavelengt h was236 nm1Hierarchical cluster

6、 analysis(HCAand p rincipal component analysis(PCAwere applied to investi2 gating t he test data1R esultsThe HCA result showed t hat25samples f rom various manufact urers and va2 rious batches can be divided into t hree group s1The differences between various dosage forms could be ob2 vio us1The cla

7、ssification result according to PCA was consistent wit h t he HCA1The PCA showed t hat eight common peaks were integrated into t hree principal component s(PCand t heir accumulation cont ribu2 ting rate amounted to821844%1The PCA result showed t hat t he relative peak area of loganin was t he dis2 c

8、riminating factor of t he fingerprint of Liuwei Dihuang Pills1ConclusionThis met hod can be used for quality control for Liuwei Dihuang Pills1K ey w ords:Liuwei Dihuang Pills;fingerprint;chemical pattern recognition收稿日期:2009203210基金項目:天津市科技發(fā)展計劃項目(05SYSYGX25000作者簡介:趙洪芝(1981,女,碩士,助理研究員,主要從事中藥質(zhì)量控制及化學(xué)計量

9、學(xué)方面的研究。Tel:(02227950255Fax:(02227950378E2mail:zhao hong zhi1261com3通訊作者孟憲生Tel:(01062772263Fax:(01062781688E2mail:mxsvvv1261com六味地黃丸是中醫(yī)補益劑中滋陰補腎的代表方劑,用于腎陰虧損,頭暈耳鳴,腰膝酸軟,骨蒸潮熱,盜汗遺精,消渴等癥。其配方由熟地黃、山茱萸(制、牡丹皮、澤瀉、山藥、茯苓等6味藥材組成。中國藥典2005年版一部六味地黃丸項下規(guī)定檢測丹皮酚和馬錢苷的量作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。但是六味地黃丸的成分十分復(fù)雜,生產(chǎn)廠家眾多,為全面評價其質(zhì)量,需借助現(xiàn)代分析手段進行研究,

10、建立新的評價方法。中藥指紋圖譜技術(shù)是一種表征中藥所含成分與其質(zhì)量關(guān)系的有效手段,現(xiàn)已成為國內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評價模式14。本課題組前期采用薄層掃描法評價了六味地黃丸(膠囊5。本實驗建立了六味地黃丸的HPL C指紋圖譜,結(jié)合聚類分析法和主成分分析法等模式識別方法,為中藥的質(zhì)量控制提供一種直觀、簡便、有效的手段。1儀器與試藥Waters alliance2695高效液相色譜儀,其配置有自動進樣器、2996二極管陣列檢測器、柱溫箱。表1樣品來源T able1Sources of samples編號生產(chǎn)廠家批號劑型編號生產(chǎn)廠家批號劑型1A6032931水蜜丸14E109426大蜜丸2A703133

11、7水蜜丸15E109429大蜜丸3B B058220水蜜丸16C640005大蜜丸4B B058207水蜜丸17C640006大蜜丸5B B058227水蜜丸18J070101濃縮丸6C6420009水蜜丸19K20060918濃縮丸7C6420011水蜜丸20K20070539濃縮丸8D0506028水蜜丸21K20070611濃縮丸9E111409水蜜丸22L97060379濃縮丸10F0605707水蜜丸23M20070426濃縮丸11G051102水蜜丸24N060701濃縮丸12H060503膠囊25O061274濃縮丸13I070301膠囊2方法與結(jié)果211色譜條件:Agilent

12、 Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×416mm,5m;流動相:乙腈2超純水,線性梯度洗脫程序:08min,乙腈由1%線性增至12%;821min,乙腈保持12%,2140min,乙腈由12%線性增至90%;40min后乙腈保持90%至50min;體積流量:110mL/min;檢測波長:236nm;進樣量:10L。212供試品溶液的制備:取本品水蜜丸切碎,取約1g;大蜜丸取約113g;濃縮丸取約013g;膠囊取約015g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲提取60min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得

13、。213對照品溶液的制備:精密稱取馬錢苷對照品、丹皮酚對照品適量,加甲醇分別制成含馬錢苷14g/mL、丹皮酚18g/mL的溶液,即得。214方法學(xué)考察21411精密度試驗:取同一供試品溶液在上述條件下連續(xù)測定6次,計算指紋峰的保留時間和峰面積的RSD值,相對保留時間RSD分別為0123%、0124%、0157%、0164%、01013%、01003%、0125%,相對峰面積RSD為1105%、0182%、0126%、0163%、1163%、1166%、0123%,各色譜峰相對保留時間穩(wěn)定,各主要色譜峰相對峰面積基本一致,RSD 小于210%。21412穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液在上述條件下,

14、分別在0、3、6、9、12、16h測定其指紋圖譜,各色譜峰保留時間RSD分別為0122%、0158%、0166%、0101%、0141%、01041%、0128%,各色譜峰保留時間穩(wěn)定,各主要色譜峰,相對峰面積RSD 分別為1169%、0192%、0132%、0149%、1153%、2182%、1102%,均小于210%,表明樣品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定。21413重復(fù)性試驗:平行取6份供試品溶液,進樣測定,計算指紋峰的保留時間和峰面積的RSD值,結(jié)果相對保留時間RSD分別為01069%、01067%、0112%、01108%、1129%、01027%、01065%,相對峰面積的RSD分別為2182

15、%、1110%、1120%、1193%、2131%、1154%、2142%,各主要色譜峰相對峰面積RSD小于310%。215樣品測定:取不同廠家的25批樣品,分別制備供試品溶液,進樣測定,確定8個主要色譜峰為共有峰。馬錢苷、丹皮酚對照品色譜圖見圖1,2號樣品的H PL C指紋圖譜見圖2,用中藥色譜的指紋圖譜評價系統(tǒng)軟件(2004A進行色譜峰的匹配,25批樣品的疊加譜圖見圖3。3模式識別研究311聚類分析法:以25個不同廠家和批次的六味地黃丸(膠囊為研究對象,進行指紋圖譜研究,獲得包括丹皮酚(7號峰在內(nèi)的8個色譜峰,將7號峰設(shè)為參比峰,規(guī)定其相對保留時間和相對峰面積為1,其他各峰面積均按相對峰面

16、積折算,將各色譜峰相對于內(nèi)參比色譜峰的峰面積量化,得到25×8階原始數(shù)據(jù)矩陣,運用SPSS統(tǒng)計分析軟件對其進行聚類分析(Hierarchical clustering analysis,利用歐氏距離(Euclidean作為樣品的測度,采用離差平方和法(Wards Met hod進行聚類,將25個樣品分為3類,見圖4。可以看出,25個樣品總共可以分為3類,其中, 16、17、7、2、15、10、14、1、6、9、24為第1類;4、20、3、5、25、19、21、23、22為第2類;12、13、18、8、11為第3類。C廠家的樣品(4、7、16、17和E廠家(9、14、15無論水蜜丸和大

17、蜜丸均為在第一類中,說明C和E廠家的樣品質(zhì)量相近,而水蜜丸和大蜜丸質(zhì)量相差并不大。而所取的B廠家樣品(2、3、5號比較緊湊,證明這幾個批號六味地黃丸質(zhì)量比較穩(wěn)定 。圖4六味地黃丸(膠囊樣品的聚類譜系圖Fig14Hierarchical cluster analysis f igureof Liuw ei DiH u ang Pills(C apsula12、13號為膠囊制劑,在聚類譜圖中距離非常相近,說明膠囊與其他劑型相差較大。濃縮丸除N廠家(24號和J廠家(18號以外,均在第2類中,說明濃縮丸和水蜜丸之間質(zhì)量有一定差異。312主成分分析:主成分分析是將原來眾多具有一定相關(guān)性的指標(biāo)重新組合成一

18、組新的相互無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來指標(biāo)的統(tǒng)計方法,也是數(shù)學(xué)上處理降維的一種方法6。主成分分析有許多同義詞,如特征值分解(eigen vector decompo sition、奇異值分解(singular value decomposition、抽象因子分析(abstract factor analysis、主因子分析(principal factor analysis、特征矢量投影(eigen vector p rojec2 tion、K2L projection等。本實驗應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件對此25個樣本進行了主成分分析,即將它們投影至低維空間來看它們之間的微細差別,先將25×

19、;8的原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理,再對其進行運算,主成分個數(shù)提取原則為主成分對應(yīng)的特征值大于1的前m個主成分。主成分分析結(jié)果如下:第一主成分的特征值1=31535,方差貢獻率為501505%;第二主成分的特征值:2=11260,方差貢獻率為181003;第三主成分的特征值3=11004,方差貢獻率為141336%。3個主成分的累計方差貢獻率為821844%,故選取前3個得分矢量來作圖,3個主成分的得分圖見圖5。圖中每個點對應(yīng)1個樣本。可知,此25個樣本可分為3類,與聚類分析結(jié)果一致,即可驗證聚類結(jié)果圖,聚類結(jié)果合理。初始因子載荷矩陣中,每一個載荷量表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)見表2。將主成分載

20、荷矩陣中的數(shù)據(jù)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根便 圖5主成分得分圖Fig15Princip al component analysis score 表2初始因子載荷矩陣T able2Matrix of initial factors峰位主成分12310151201432-01608201886-0126501270301928-01039701014440177201439-01125501706-016100113460172901233011268-0104440161801715得到兩個主成分中每個指標(biāo)所對應(yīng)的系數(shù),經(jīng)計算可得主成分的模型為:F1=01272X1+01471X2+ 014

21、94X3+01411X4+01376X5+01388X6-01024X8;F2=01385X1-01236X2-01035X3+ 01391X4-01543X5+01207X6+01551X8;F3= -01607X1+01269X2+01014X3-01125X4+ 01134X5+01126X6+01714X8。F1、F2、F3分別表示3個主成分,X1、X2X8分別表示各個色譜峰(峰1、2、8的相對于標(biāo)準(zhǔn)峰(峰7的相對峰面積。而3個主成分中,F1是特征值最大的,即是“信息最多”的指標(biāo),而第一主成分中系數(shù)最大的為X3,即為峰3相對于峰7的面積,從對照品色譜圖(圖2可知,峰3為馬錢苷,峰7為丹皮酚,證明馬錢苷的量在六味地黃丸的質(zhì)量控制中起相對比較重要的作用。4討論中成藥系復(fù)方制劑,其化學(xué)成分甚為復(fù)雜,其作用往往是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果,而不僅僅是其中某幾個有效成分的個別功效。本實驗對收集到的25個六味地黃丸樣品進行了H PL C指紋圖譜研究,并使用聚類分析及主成分分析化學(xué)模式識別的方法,對其數(shù)據(jù)進行了分析,兩種方法分類結(jié)果可以互相印證,表明方法合理,說明將指紋圖譜和模式識別結(jié)合進行質(zhì)量控制是一種行之有效的方法。且使用主成分分析表明,馬錢苷在六味地黃丸質(zhì)量中起相對重要的作用,中國藥典2005年版