1、第二部分：Spectrophotometry Principle 分光光度法檢測原理 所以：待測物濃度可以由檢測其顏色深淺得到。不同濃度，顏色深淺不一。沒有顏色？間接：通過生化反應生成有色物質，間接計算得到濃度。雙縮脲反應分光光度法的原理基礎：Lambert-Beer Law ，I 入射光及通過樣品后的透射光強度；A吸光度(absorbance) ；C樣品濃度；d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k光被吸收的比例系數；T透射比，即透射光強度與入射光強度之比。簡而言之，光被一定濃度介質吸收的比例與入射光的強度無關；在光程上每等厚層介質吸收相同比例值的光。 Lambert-Beer Law的適用范

2、圍：(1) 入射光為平行單色光且垂直照射.(2) 吸光物質為均勻非散射體系.(3) 吸光質點之間無相互作用.(4) 輻射與物質之間的作用僅限于光吸收,無熒光和光化學現象發生.(5) 待測物在一定溶度范圍之內.為什么需要平行單色光？ 在非單色光的條件下，由于待測物質在各個波段下吸光系數 K 的不同，造成相關曲線也出現不同程度的偏離。 實際上，理論上的單色光是不存在的，我們所做的只能是讓入射光的光譜帶寬盡可能的小，要盡可能的靠近單色光。為什么僅適用一定范圍內？ Lambert-Beer Law在有解離、締合、生成絡合物或溶劑化等會對比爾定律產生偏離。 解離是偏離朗伯-比爾定律的主要化學因素，當溶液

3、濃度（大于0.01mmol/L）改變，解離程度也會發生變化，吸光度與濃度的比例關系便發生變化，導致偏離朗伯-比爾定律。前分光模式1、光源燈發出全波段光線2、單色器將全波段光線分為某一波長的單色平行光3、單色平行光經過反應杯溶液4、光電信號接收器檢測光線強度后分光模式5、光電信號檢測各種光線強度4、衍射光柵將出射光線分為不同波長的單色光3、平行光經過反應杯溶液1、光源燈發出全波段光線2、光線經凸透鏡整理成為不同波段平行光雙波長模式在雙波長模式下A=A（主波長）-A（副波長）較單波長的優點：1、電壓不穩定等環境影響下，由于主副波長都產生了相同程度的影響而被消除2、一些常見的干擾因素如輕度溶血，將可

4、以由于在主波長和副波長具有相同的吸光度而被間接消除3、雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響在羅氏儀器上，待測物的12個波長的吸光度都被檢測，選擇設定中的2個波長進行計算。分光光度法的分析類型一，終點法1-Point End Assay2-Point End Assay二，速率法2-Point Rate AssayRate Assay1Point End：僅檢測反應終點的吸光度2-point end assay :檢測2個點的吸光度，一點反應啟動前樣品空白的吸光度，另一點為反應啟動后的吸光度。2-Point End Assay反應圖

5、：2-Point Rate Assay：檢測兩個不同時間點之間的吸光度之差，除以時間差得到的變化率1個或多個反應試劑檢測2個點吸光度用于計算通過 Abs/min來計算檢測項目的量2-point Rate assay反應圖1個或多個反應試劑通過最小二乘法計算反應曲線，得到待測物的量或活性Rate A：一定時間連續多次測定反應過程中某一反應產物或底物量隨時間變化的數據，間接計算檢測項目的量的方法。Rate A反應圖：檢測方法檢測方法檢測物質檢測物質Examples Examples 校準方法校準方法1點終點法底物類TG, CHOL2點線性校準2點終點法底物類TP,ALB, Glu ，TB, DB,

6、 Ca ,Pho , UA,HDL ,LDL 2點線性校準特定蛋白類HSCRP, HbA1c多點非線性校準速率A法酶類AST, ALT, GGT, LDH, CK2點線性校準底物CREA Jaffe, UREA, Ammonia , TDM2點線性校準2點速率法底物UREA, ACP，Urinary/CSF protin2點線性校準光度分析校準及報警Calibration quality criteriaCalibration quality criteria校準限制界校準限制界面面Utility Application screenUtility Application screenSD L

7、imit(SD Limit(標準差限制標準差限制) :) :實測吸光度和理論計算吸光度的差異實測吸光度和理論計算吸光度的差異Duplicate limit (Duplicate limit (重復性限制重復性限制):):重復性限制重復性限制, ,相對范圍相對范圍% %和絕對范圍和絕對范圍Sensitivity limitSensitivity limit( (靈敏度限制靈敏度限制) ) : :空白濃度和空白濃度和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變化之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值差異的最大值和最小值 S1 Absorbance Limit(S1 Absorbanc

8、e Limit(空白限制空白限制) :) :試劑空白就是待測物濃度為試劑空白就是待測物濃度為0 0時的吸光度時的吸光度. .校準報告校準報告CHOCHOStd1,2Std1,2雙波長雙波長檢測吸光度差檢測吸光度差Std1,2Std1,2主波長主波長檢測吸光度檢測吸光度校準報警校準報警校準結果校準結果K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K = (CN Cb) K = (CN Cb) (AN Ab) (AN Ab)SD Limit(SD Limit(標準差限制標準差限制):):常見校

9、準校準失敗常見校準校準失敗的原因的原因1.1. 校準的放置順序可能有誤（多個校準的放置順序可能有誤（多個校準品）校準品）2.2. 單個校準品自動稀釋后校準單個校準品自動稀釋后校準 加樣精度問題加樣精度問題3.3. 比色杯或光源燈老化比色杯或光源燈老化4.4. 污染的或蒸發濃縮的校準品污染的或蒸發濃縮的校準品5.5. 混勻機構問題混勻機構問題Duplicate limit :重復性限制 檢查同一個校準品的兩次吸光度差異Abs1 - Ab2 校準的時候,每個校準品會重復做兩次進行計算原因：如果是新試劑，檢查試劑復溶及混勻情況檢查樣品針和試劑針.樣品或試劑上有氣泡光源燈或比色杯老化混勻不佳Sensi

10、tivity limit(Sensitivity limit(靈敏度靈敏度限制限制) ) 該數值標識出空白和該數值標識出空白和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值化差異的最大值和最小值 . . 在終點法的生化項目校準中，最小吸光度變化是必須檢測在終點法的生化項目校準中，最小吸光度變化是必須檢測的標準的標準 Sen:Sen:Sensitivity limit(Sensitivity limit(靈敏度限制靈敏度限制):):常見校準校常見校準校準失敗的原因準失敗的原因1.1. 錯誤的校準品錯誤的校準品 蒸發濃縮或配制錯誤蒸發濃縮或配制錯誤

11、2.2. 舊的或污染的試劑舊的或污染的試劑3.3. 污染的空白校準品污染的空白校準品空白和CFAS校準品的測得的吸光度值過于接近校準失敗校準失敗校準液校準液（1 1）吸光度）吸光度Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance S1 Abs S1 Abs 用于檢查用于檢查線性或非線性線性或非線性校準。校準。報警用于指示第一點校準品吸光度是否超出范圍。報警用于指示第一點校準品吸光度是否超出范圍。S1 AbsS1 Abs定義校準品定義校準品1 1水平的上限和下限。水平的上限和下限。用于檢測試劑空白用于檢測試劑空白。校準報警校準報警DUPSENS1 Abs L

12、imitCalib. Limit常見報警類型常見報警類型潛在原因潛在原因Duplicate LimitDuplicate Limit加樣不準加樣不準 ( (樣本、試劑樣本、試劑) )，攪拌，攪拌 (P)(P)，反應杯，反應杯光源老舊，環境，光源老舊，環境， 電壓電壓Sensitivity LimitSensitivity Limit校準品、水點污染，試劑，校準品單位更改校準品、水點污染，試劑，校準品單位更改未更改數值未更改數值Calibration LimitCalibration Limitcfascfas和水空白，加樣不準，系統水，光源燈和水空白，加樣不準，系統水，光源燈Standard

13、Deviation Standard Deviation LimitLimit不正確的加樣順序，光路，針不正確的加樣順序，光路，針( (加樣不精確加樣不精確) )Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance 水質，試劑，光源水質，試劑，光源Standard ErrorStandard Error儀器，反應過程，其它校準報警儀器，反應過程，其它校準報警造成生化校準報警的潛在可能原因造成生化校準報警的潛在可能原因校準報警校準報警校準報警校準報警校準報警校準報警校準曲線校準曲線Duplicate LimitDuplicate Limit重復性限制重復性限制不

14、更新不更新Sensitivity LimitSensitivity Limit靈敏度限制靈敏度限制不更新不更新Calibration LimitCalibration Limit校準限制校準限制更新更新Standard Deviation Standard Deviation LimitLimit標準差限制標準差限制可能更新可能更新Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance Std1Std1吸光度吸光度不更新不更新Standard ErrorStandard Error標準錯誤伴隨標準錯誤伴隨不更新不更新如果校準失敗，系統將自動使用之前有效的校準曲線

15、計算標本濃度。如果校準失敗，系統將自動使用之前有效的校準曲線計算標本濃度。生化項目檢測常用顯色指示系統1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統2，p-NP（磷酸對硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統 3，H2O2偶聯的指示系統 4，抗原抗體反應指示系統，免疫比濁法 5，其它顯色反應 1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統：反應原理 ： NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征性吸收峰，而 NAD+和 NADP+在 340nm無特征性吸收峰，利用其偶聯的脫氫酶(工具酶)反應，根據 340nm 吸光度的變化，可以測定物質的濃度或 活性。 臨床項目：ALT、A

16、ST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH 、 Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2 等 1.5.2.2. 舉例說明ALT的測定原理（IFCC） 試劑成分和反應公式： R1： NADH 、乳酸脫氫酶（LDH）； R2： L-丙氨酸 、-酮戊二酸 。 原理：NADH 的減少，引起 340nm 吸光度的下降，下降速率與 ALT 活性成正比(酶動力學法)。2，p-NP（磷酸對硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統 反應原理： p-NP 和 p-NA 在 405nm 有特征性吸收峰，根據 405nm 吸光度的變化，可以測定物質的濃 度或活。臨床項目： ALP、ACP、r-GT、AMY

17、 等。 舉例說明 ：ALP的測定原理（IFCC） 試劑成分和反應公式。R1：AMP 緩沖液，鎂離子，鋅離子，PH10.44； R2：對硝基苯磷酸，防腐劑，PH8.5 原理：在鎂離子和鋅離子的存在下，堿性磷酸酶解離對硝基苯磷酸形成磷酸鹽和對硝基苯酚， 引起 405nm 吸光度的上升，上升速率與 ALP 活性成正比（動力學法）。 3，H2O2偶聯的指示系統 反應原理： H2O2在過氧化物酶的作用下，可使單一個或成對的無色的色素原氧化成有色的色素，導致某 一波長吸光度的增加，因此可用來測定物質的濃度或活性。 臨床項目：過氧化物酶法CHOL，GLU舉例說明: GLU 過氧化物酶法的測定原理R1：4-氨

18、基安替吡啉 、抗壞血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、過氧化物酶（PO D）、酚 。 測定原理：醌亞胺的生成，導致 500nm 吸光度的增加，增加的程度與 Glu 的含量成正比。4，抗原抗體反應指示系統，免疫比濁法 反應原理：特異性抗體與抗原(待測物質)在相應的緩沖環境下反應生成抗原抗體復合物，形成一定的濁 度，導致特定波長透光率的改變。在抗體過剩的前提下，改變程度與抗原濃度成正比。 臨床項目： apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、 C4、CRP 等。 5，其它顯色反應TP 的反應原理 ：蛋白質中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子作用產生紫紅色絡合物，導致 540n

19、m 吸光度的增 加，增加的程度與蛋白質的含量成正比。 ALB 的反應原理： 在 pH4.2 環境中，溴甲酚綠在有非離子去垢劑聚氧乙烯月桂存在時，可與白蛋白形成藍綠色復合物，導致 630nm 吸光度的增加，增加的程度與白蛋白的含量成正比。 其它的顯色反應還有 Ca 和 Mg 等物質的測量方法， c 701c 702c 502/501應用數 光度200200200 計算檢測888 血清指數333分析通量（最大）2000 個測試/小時2000 個測試/小時600 個測試/小時反應體積100-250 L100-250 L100-250 L反應溫度（孵育池）37 0.1C37 0.1C37 0.1C反應

20、杯406 池（14 區域）406 池（14 區域）160 池（8 區域）反應時間1-分鐘步驟中 3-10 分鐘 1-分鐘步驟中 3-10 分鐘1-分鐘步驟中 3-10 分鐘移液循環1.8 s1.8 s6 s復合方法非接觸超聲混合非接觸超聲混合非接觸超聲混合表 9-3 反應系統反應系統 c 701c 702c 502/501試劑盒類型 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 中等容量試劑盒 cobas c pack MULTI 中等容量試劑盒試劑加載/卸載手

21、動自動（試劑管理站進行） 自動試劑識別自動（RFID）試劑管理站中自動（RFID）自動（條碼） 最大量試劑盒7070 （試劑管理站中附加 10 個） 60 試劑冷卻（試劑盤中）5-155-155-12試劑緩沖轉子容量-10 個試劑盒-試劑卸載托盤容量-12 個試劑盒10 個試劑盒試劑移液時間安排（最多使用 3 個時間點）R1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.2 sR2：90.2 sR3：300.2 s試劑移液量5-180 L、增加幅度為 1 L（5-19 L：+ 20 L 水）質控品剩余試劑體積移液 LLD 與

22、自動檢測讀數移液 LLD 與自動檢測讀數表 9-4 試劑系統試劑系統 c 701c 702c 502/501樣品類型 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 全血 其他樣品移液量1.5-35L，每次增加0.1L樣品堵塞探測壓力靈敏式凝塊探測系統液面傳感器電容傳感技術表 9-5 取樣系統取樣系統 c 701c 702c 502光源鹵素燈，12 V / 50W光度計多波長分光光度計波長12種波長可供選擇：340，376，415，450，480，505，546，570，600，660，700，800 nm光路長度5.6 mm光程吸光度0.0000-3.3000線性吸光度不高于2.5光模式單色光和雙色光光度測定系統光度測定分析的流程1清洗反應杯啟動后，機械部件將重設并回位。儀器開始進行反應池沖洗。反應盤持續旋轉。沖洗噴嘴 A 從反應池吸取反應混合物。數個循環后，通過沖洗噴嘴 B/C，使用去離子水對反應池進行清洗。下一步，使用 CellCln 1，于沖洗臂中，通過噴嘴 D/E 對反應池進行清洗。使用CellCln 2，于沖洗臂中，通過噴嘴 F