1、 作者作者 : 齊煒煒齊煒煒 高國全高國全: 第十二章第十二章 DNA合成合成目錄第一節(jié)第一節(jié) DNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律第二節(jié)第二節(jié) DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA復(fù)制過程復(fù)制過程第四節(jié)第四節(jié) 真核生物真核生物DNA復(fù)制過程復(fù)制過程第五節(jié)第五節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄重點難點重點難點熟悉熟悉了解了解掌握掌握掌握掌握DNA復(fù)制體系的組成、半保留復(fù)制的特點及其意義；掌復(fù)制體系的組成、半保留復(fù)制的特點及其意義；掌握握DNA復(fù)制的基本規(guī)律，復(fù)制的基本規(guī)律， DNA聚合酶的類型及功能特點聚合酶的類型及功能特點DNA復(fù)制的過程，原核復(fù)制的過程，原核DNA復(fù)制

2、與真核復(fù)制與真核DNA復(fù)制的主要區(qū)復(fù)制的主要區(qū)別；真核生物別；真核生物DNA端粒及端粒酶端粒及端粒酶非染色體非染色體DNA復(fù)制的其他形式；了解逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中復(fù)制的其他形式；了解逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則心法則DNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律The basic law of DNA replication第一節(jié)第一節(jié) DNA復(fù)制的主要特征復(fù)制的主要特征: 半保留復(fù)制(semi-conservative replication) 雙向復(fù)制(bidirectional replication) 半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication)在復(fù)制時，親代雙鏈在復(fù)

3、制時，親代雙鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，解開為兩股單鏈，各自作為模板，依據(jù)堿基配對規(guī)律，合成序列互補的子鏈依據(jù)堿基配對規(guī)律，合成序列互補的子鏈DNA雙鏈雙鏈一、一、DNA以半保留方式進行復(fù)制以半保留方式進行復(fù)制 半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的概念: 子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度實驗密度梯度實驗:含含15N-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代依據(jù)半保留復(fù)制的方式，子代依據(jù)半保留復(fù)制的方式，子代DNA中保留

4、了親代的全部遺中保留了親代的全部遺傳信息，親代與子代傳信息，親代與子代DNA之間堿基序列的高度一致之間堿基序列的高度一致遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的 半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義: TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母鏈母鏈DNA復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉的復(fù)制叉子代子代D

5、NA二、二、DNA復(fù)制從起始點雙向進行復(fù)制從起始點雙向進行 原核生物基因組是環(huán)狀原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個復(fù)制起點，只有一個復(fù)制起點（origin）。復(fù)制從起點開始，向兩個方向進行解鏈，進）。復(fù)制從起點開始，向兩個方向進行解鏈，進行的是單點起始雙向復(fù)制行的是單點起始雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象復(fù)制中的放射自顯影圖象A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter)oriterA B C 真核生物每個染色體又有多個起點，呈多起點雙向復(fù)制特真核生物每個染色體又有多個起點，呈

6、多起點雙向復(fù)制特征。每個起點產(chǎn)生兩個移動方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成征。每個起點產(chǎn)生兩個移動方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時，復(fù)制叉相遇并匯合連接。從一個時，復(fù)制叉相遇并匯合連接。從一個DNA復(fù)制起點起始復(fù)制起點起始的的DNA復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子（復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子（replicon）。復(fù)制子是含）。復(fù)制子是含有一個復(fù)制起點的獨立完成復(fù)制的功能單位有一個復(fù)制起點的獨立完成復(fù)制的功能單位53oriorioriori5353oriorioriori535533553復(fù)制復(fù)制3三、三、DNA復(fù)制以半不連續(xù)方式進行復(fù)制以半不連續(xù)方式進行3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(lead

7、ing strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 沿著解鏈方向生成的子鏈DNA的合成是連續(xù)進行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈（leading strand） 另一股鏈因為復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)延長，只能隨著模板鏈的解開，逐段地從53生成引物并復(fù)制子鏈。模板被打開一段，起始合成一段子鏈；再打開一段，再起始合成另一段子鏈，這一不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈（lagging strand） 沿著后隨鏈的模板鏈合成的新DNA片段被命名為岡崎片段（Okazaki fragment）四、四、DNA復(fù)制具有高保真性復(fù)制具有高保真性 “半保留復(fù)制半保留復(fù)制”確保親代和子代確保親代和子代DNA分子之

8、間信息傳遞分子之間信息傳遞的絕對保真性的絕對保真性 高保真度高保真度DNA聚合酶利用嚴格的堿基配對原則是保證復(fù)聚合酶利用嚴格的堿基配對原則是保證復(fù)制保真性的機制之一；體內(nèi)復(fù)制叉的復(fù)雜結(jié)構(gòu)提高了復(fù)制制保真性的機制之一；體內(nèi)復(fù)制叉的復(fù)雜結(jié)構(gòu)提高了復(fù)制的準確性；的準確性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校讀功能以聚合酶的核酸外切酶活性和校讀功能以及復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)對錯配加以糾正及復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)對錯配加以糾正DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)復(fù)制的酶學(xué)和拓撲學(xué)Enzymology and topology of DNA replication第二節(jié)第二節(jié) 參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì): 底物(substrat

9、e): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為 DNA-pol 模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白質(zhì)因子(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi一、一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合 全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 簡稱：DNA-pol 活性： 1. 53的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性

10、: 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 ? 35外切酶活性: 能辨認錯配的堿基對，并將其水解 53外切酶活性: 能切除突變的 DNA片段（一）原核生物有（一）原核生物有3種種DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 分子量（kD）109120250組成單肽鏈？多亞基不對稱二聚體分子數(shù)/細胞400？2053核酸外切酶活性有無無基因突變后的致死性可能不可能可能原核生物的DNA聚合酶個核心酶個核

11、心酶1個個 -復(fù)合物（復(fù)合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞基）基）1對對 -亞基（可滑動亞基（可滑動的的DNA夾子）夾子）全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括： DNA聚合酶聚合酶全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu): 亞基亞基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亞基亞基具有具有35 外切酶活性（復(fù)制保真性外切酶活性（復(fù)制保真性所必需）所必需） 亞基可增強其活性亞基可增強其活性 亞基亞基可能起組裝作用可能起組裝作用核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成：兩側(cè)的兩側(cè)的亞基發(fā)揮夾穩(wěn)亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNA模板鏈，并使酶沿模模板鏈，并使酶沿模板滑動的作用板滑動的作用2個個 -亞基亞基分別和分別和1個核心

12、酶相互作用，個核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個全酶分子個全酶分子的的2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責(zé)合個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈成前導(dǎo)鏈和后隨鏈功能：功能：有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用活性的作用 -復(fù)合物復(fù)合物由由6種亞基組成：種亞基組成： 、 、 、 、 、 對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補隙進行填補功能：功能： DNA-pol （109kD）:323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸

13、外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA，進行，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶分子生物學(xué)研究中常用的工具酶 DNA-pol （120kD）: DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活基因發(fā)生突變，細菌依然能存活 DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的DNA模模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它參與板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認為，它

14、參與DNA損傷的應(yīng)損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)急狀態(tài)修復(fù)（一）常見的真核細胞（一）常見的真核細胞DNA聚合酶有聚合酶有5種種 DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性起始引發(fā)，有引物酶活性 DNA-pol 參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 DNA-pol 在線粒體在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用復(fù)制中起催化作用 DNA-pol 合成后隨鏈合成后隨鏈 DNA-pol 合成前導(dǎo)鏈合成前導(dǎo)鏈E.Coli真核細胞真核細胞 功能功能填補復(fù)制中的填補復(fù)制中的DNA空隙，空隙，DNA修復(fù)和重組修復(fù)和重組復(fù)制中的校對，復(fù)制中的校對，DNA修復(fù)修復(fù) DNA修復(fù)修復(fù) 線粒體線粒體DNA合成合成 前導(dǎo)鏈合成前導(dǎo)鏈合成DnaG

15、 引物酶引物酶 后隨鏈合成后隨鏈合成真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較 DNA-pol 分子量（分子量（kD）16.54.014.012.525.553聚合活性聚合活性中中？高高高高高高35核酸外切核酸外切酶活性酶活性-+功能功能起始引發(fā)，起始引發(fā)，引物酶活性引物酶活性低保真度的復(fù)低保真度的復(fù)制制線粒體線粒體DNA復(fù)制復(fù)制合成后隨鏈合成后隨鏈合成前導(dǎo)鏈合成前導(dǎo)鏈真核生物的DNA聚合酶二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對功能聚合酶的堿基選擇和校對功能DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制:遵守嚴格的堿基配對規(guī)律聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能復(fù)制出錯時有即時校對功

16、能（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇 利用利用“錯配錯配”實驗發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)，DNA pol 對核苷酸的參入對核苷酸的參入（incorporation）具有選擇功能）具有選擇功能 DNA pol 對不同構(gòu)型糖苷鍵表現(xiàn)不同親和力，因此實對不同構(gòu)型糖苷鍵表現(xiàn)不同親和力，因此實現(xiàn)其選擇功能現(xiàn)其選擇功能 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復(fù)制中（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認切除錯配堿基并加以校正辨認切除錯配堿基并加以校正 核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，

17、外切酶是有方向性的酶，外切酶是有方向性的 A：DNA-pol的外切酶活性切除的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物入正確配對的底物B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不不表現(xiàn)活性表現(xiàn)活性DNA pol 的校的校讀功能讀功能三、復(fù)制中三、復(fù)制中DNA 分子拓撲學(xué)變化分子拓撲學(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。 蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能DnaA（dnaA） 辨認復(fù)制起始點DnaB（dnaB）解旋酶解開DNA雙鏈Dn

18、aC（dnaC） 運送和協(xié)同DnaBDnaG（dnaG）引發(fā)酶催化RNA引物生成SSB單鏈結(jié)合蛋白/DNA結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開的單鏈DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶又稱促旋酶解開超螺旋原核生物復(fù)制中參與DNA解鏈的相關(guān)蛋白質(zhì)（一）多種酶參與（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài) 解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈 引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶 單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整解鏈過程中正

19、超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成.復(fù)制過程正超螺旋的形成：復(fù)制過程正超螺旋的形成：ABCDNA只固定一端DNA兩端固定解開10個堿基對（一個螺旋）DNA將會旋轉(zhuǎn)一圈DNA形成一個超螺旋解開10個堿基對（一個螺旋）蛋白分子DNA負超螺旋開口易化正超螺旋開口受阻拓撲異構(gòu)酶作用特點拓撲異構(gòu)酶作用特點:既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵拓撲異構(gòu)酶分類及作用機制：拓撲異構(gòu)酶分類及作用機制： 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：切斷：切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股鏈一股鏈，使，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當 時候封閉切口，時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需反應(yīng)不需ATP 拓撲異構(gòu)

20、酶拓撲異構(gòu)酶：切斷：切斷DNA分子分子兩股鏈兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛 利用利用ATP供能供能，連接斷端，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)分子進入負超螺旋狀態(tài)拓撲酶的作用方式：拓撲酶的作用方式：四、四、DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈鏈連接成一條完整的鏈DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式：DNA連接酶的作用：連接

21、酶的作用：功能功能:DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用也是基因工程的重要工具酶之一DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較 提供核糖提供核糖3 3 -OH-OH提供提供5 5 -P-P結(jié)果結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)連續(xù)鏈拓撲酶切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)原核生物原核生物DNA復(fù)制過程復(fù)制過程DNA replication in prokaryotes第三節(jié)第三節(jié)起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程中起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程中，各種酶和

22、蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引發(fā)體，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成，形成復(fù)制叉并合成RNA引物引物需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板解開成單鏈，提供模板2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供形成引發(fā)體，合成引物，提供3 -OH末端末端一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈 （此圖有誤需修改）（此圖錯誤部分包括文字和少了一個9bp重復(fù)序列已在圖中標注，請編輯幫忙修改） Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和起始復(fù)合物形成（二

23、）引物合成和起始復(fù)合物形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為起始復(fù)合物復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為起始復(fù)合物.起始復(fù)合物和復(fù)制叉的生成起始復(fù)合物和復(fù)制叉的生成3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子分子引物引物3 HO5引物引物酶酶二、二、DNA鏈的延長鏈的延長復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成 5 5 3 35 5

24、dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5 3 方向可以連續(xù)地延長方向可以連續(xù)地延長后隨鏈的合成后隨鏈的合成 在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合處匯合oriter E.coli8232 ori terSV40500三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止5 5 5 DNA-pol OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi

25、5 5 DNA連接酶連接酶子鏈中的子鏈中的RNA引物被取代引物被取代真核生物真核生物DNA復(fù)制過程復(fù)制過程Eukaryotic DNA replication process第四節(jié)第四節(jié)真核生物與原核生物真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：復(fù)制的差異：真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進速度慢等DNA復(fù)制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等 哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期DNA合成期合成期G1G2SM細胞能否分裂，決定于進入細胞能否分裂，決定于進入S期及期及M期這兩個關(guān)期這兩個關(guān)鍵點。鍵點。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶

26、活的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)性有關(guān) 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實施調(diào)控作用而實施調(diào)控作用 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式子復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步啟動激活而不是同步啟動 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）、（引物酶活性）、pol 和和pol 參與。還需解螺旋酶活性、拓撲參與。還需解螺旋酶活性、拓撲酶和復(fù)制因子酶和復(fù)制因子(replication factor, RF) 一、真核生物復(fù)制的起始與原核基

27、本相似一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似酵母復(fù)制起點為酵母復(fù)制起點為自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色體含有多個復(fù)制起點。酵母染色體含有多個復(fù)制起點。 元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：結(jié)合一個特異的蛋白：結(jié)合一個特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物質(zhì)復(fù)合物復(fù)制起點識別復(fù)合物復(fù)制起點識別復(fù)合物(ORC) 3個序列個序列(B1、B2和和B3)可以增加復(fù)制起點的效率，可以增加復(fù)制起點的效率，其中其中B2的的9個堿基與上述個堿基與上述ARS共有序列相同共有序列相同酵母復(fù)制起始點酵母復(fù)制起始點拓撲異構(gòu)酶，去除負超螺旋（

28、使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正拓撲異構(gòu)酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋超螺旋Tol和和TolDNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶解旋酶連接岡崎片段連接岡崎片段DNA連接酶連接酶核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物RNAse H核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物FEN1DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶有依賴有依賴DNA的的ATPase活性，結(jié)合于引物活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活模板鏈，激活DNA聚合酶，聚

29、合酶， 促使促使PCNA結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模板鏈模板鏈RFC激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性PCNA單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNARPA功功 能能蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)真核真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能 現(xiàn)在認為現(xiàn)在認為pol 主要催化合成引物，然后迅速被主要催化合成引物，然后迅速被具有連續(xù)合成能力的具有連續(xù)合成能力的DNA pol 和和DNA pol 所所替換，這一過程稱為聚合酶轉(zhuǎn)換。替換，這一過程稱為聚合酶轉(zhuǎn)換。DNA pol 負負責(zé)合成后隨鏈，責(zé)合成后隨鏈，DNA pol

30、 負責(zé)合成前導(dǎo)鏈。負責(zé)合成前導(dǎo)鏈。二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換聚合酶轉(zhuǎn)換 前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換的原因是聚合酶轉(zhuǎn)換的原因是Pol 不具備不具備持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力 DNA聚合酶轉(zhuǎn)換的聚合酶轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是關(guān)鍵蛋白是RFCDNA聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換真核真核DNA聚聚合酶轉(zhuǎn)換和合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成后隨鏈合成3 5 5 3 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈3 5 3 5 親代親代DNA后隨鏈后隨鏈引物引物核小體核小體三、真核生物三、真核生物DNA合成后立

31、即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體染色體染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止呈線狀，復(fù)制在末端停止復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物引物，去除后留下空隙，去除后留下空隙四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題切除引物的兩種機制切除引物的兩種機制線性DNA復(fù)制一次端粒縮短 5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 端粒（端粒（telomeres）由富含）由富含TG的重復(fù)序列組成的重復(fù)序列組成 人的端粒重復(fù)序列為人的端粒重復(fù)序列為5-(T

32、nGn)x-3 這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個染色體的3端比端比5 端長，形成單鏈端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結(jié)構(gòu)。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體末端復(fù)制問題可解決染色體末端復(fù)制問題組成：組成：端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白

33、（是一種核糖核蛋白（RNP），由），由RNA和蛋白質(zhì)組成和蛋白質(zhì)組成 端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的組分作為模板，以染色體的3端端ssDNA（后隨鏈模板）（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于染色體為引物，將端粒序列添加于染色體的的3端。這些新合成的端。這些新合成的DNA為單鏈為單鏈端粒酶催化作用的爬行和端粒的延長過程端粒酶催化作用的爬行和端粒的延長過程 真核所有染色體真核所有染色體DNA復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細胞復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細胞周期的周期的S期，而且只能復(fù)制一次期，而且只能復(fù)制一次五、真核生物染色體五、真核生物染色體DNA在每個細胞周在每個細胞周期中只能復(fù)制一次期中只能

34、復(fù)制一次前復(fù)制復(fù)合物在前復(fù)制復(fù)合物在G1期形成而在期形成而在S期被激活期被激活真核細胞真核細胞DNA復(fù)制的起始分兩步進行，即復(fù)復(fù)制的起始分兩步進行，即復(fù)制基因的選擇和復(fù)制起點的激活制基因的選擇和復(fù)制起點的激活復(fù)制基因（復(fù)制基因（replicator）是指）是指DNA復(fù)制起始復(fù)制起始所必需的全部所必需的全部DNA序列序列ORC至少募集兩種解旋酶加載至少募集兩種解旋酶加載蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1復(fù)制起點識別復(fù)合物（復(fù)制起點識別復(fù)合物（originrecognition complex，ORC）識別并結(jié)合復(fù)制基因）識別并結(jié)合復(fù)制基因三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞三種蛋白質(zhì)一起募集真核細胞解旋酶解旋酶

35、Mcm2-7前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-RC）的形成）的形成pre-RC的激活的激活和組裝真核和組裝真核DNA復(fù)制叉復(fù)制叉 激活激活pre-RC，以起始，以起始DNA復(fù)制復(fù)制 抑制形成新的抑制形成新的pre-RCCDK控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent kinases，CDK）嚴格）嚴格控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活Cdk功能：功能：D-環(huán)復(fù)制（環(huán)復(fù)制（D-loop replication）是線粒）是線粒體體DNA的復(fù)制形式的復(fù)制形式六、真核生物線粒體

36、六、真核生物線粒體DNA按按D環(huán)方式復(fù)環(huán)方式復(fù)制制dNTPDNA-pol 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄reverse transcription第五節(jié)第五節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA以逆以逆轉(zhuǎn)錄機制復(fù)制轉(zhuǎn)錄機制復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA 模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈雜化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNARNA病毒在細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈病毒在細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的的前病

37、毒前病毒(provirus)。前。前病毒保留了病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖。 在 某 些 情 況 下 ， 前 病 毒 基 因 組 通 過。 在 某 些 情 況 下 ， 前 病 毒 基 因 組 通 過 基 因 重 組基 因 重 組(recombination)，參加到細胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一，參加到細胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達。這種重組方式稱為起復(fù)制和表達。這種重組方式稱為整合整合(integration)。前病。前病毒獨立繁殖或整合，都可成為致病的原因毒獨立繁殖或整合，都可成為致病的原因 逆轉(zhuǎn)錄酶催化的逆轉(zhuǎn)錄酶催化的cDNA合成合成分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法