1、1 前言土壤鹽堿化是人類面臨的一個世界性問題，開發和有效利用鹽漬化和具有重要的現實意義。提高植物的耐鹽是開發和利用大量鹽漬化土地最有效的方法之一，也是未來農業發展的重大課題之一。采用傳統的方法選育耐鹽的植物品種固然簡便可行，但進展緩慢，局限性大。隨著分子生物學技術的發展，一大批與植物耐鹽有關的基因相繼得到克隆，植物轉基因技術有了重大突破，這為有效利用鹽堿地提高作物產量，治理鹽漬化土地提供了新的思路和方法。百脈根(Lotus corniculatus L)是豆科百脈根屬多年生牧草，又名牛角花、五葉草，蝶形花科多年生草本植物，產于歐亞溫暖地區，目前在世界各地廣泛種植，我國華東、華中、西南及西北均有

2、分布1。該牧草營養豐富，耐寒、抗旱、耐澇、蟲害少，花量大、自交結實、種子結實率高，較易得到穩定遺傳的后代；其細胞再生性在豆科牧草中是最好的，遺傳轉化效率相對較高，且轉基因植株生長速度快。因此，百脈根是研究外源基因轉化、生物固氮機理、牧草品質改良的豆科模式植物。盡管有許多優點，但其大多數百脈根栽培品種苗期生長緩慢、抗逆性差，這給產業化生產帶來許多不便。因此，在常規育種的基礎上，利用生物技術對其加以遺傳改良，以培育出優質、高產的新品種，對改良和利用我國大面積的鹽堿地和荒漠化土地具有重要意義。液泡膜H+-PPase（V-H+-PPase）是分布于大多數陸生植物細胞中的一種獨特的酸化液泡的質子泵2。H

3、+-PPase是植物液泡膜上普遍而豐富的成分,液泡膜H+轉運無機焦磷酸酶（H+-PPase）的主要功能有（1）具有質子泵的功能。（2）能夠參與蔗糖的生物合成。（3）控制植物生長素的運輸。（4）在植物的抗鹽脅迫中發揮重要作用 3。孫艷香等人采用EST電子克隆和RACE技術從豆科模式植物百脈根中克隆到一個液泡膜H+-PPase基因的cDNA，命名為LcVP1。該cDNA長為2962bp，含2304bp的完整開放閱讀框，編碼767個氨基酸，其推測的氨基酸序列與綠豆、擬南芥等I類液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性在80以上，且有很高的功能區段保守性4 。不同的V-H+-PPase異構體在不同組織

4、和器官中特異性表達，這樣可以產生大量的V-H+-PPase?？梢?，植物不同器官組織V-H+-PPase含量受到有效調節，有利于提高適應脅迫的能力。已有將LcVP1的同源基因AVP1的超表達提高了轉基因百脈根的耐鹽性 5，但至今還沒有將LcVP1基因轉入百脈根中改變植株V-H+-PPase活性以提高其耐鹽性的相關報道。本研究的目的就是將LcVP1基因轉入百脈根獲得的轉基因植株，其PCR檢測呈陽性，對植株鹽脅迫處理后，測定其耐鹽性。2材料與方法2.1 材料以野生型和經PCR檢測陽性轉LcVP1基因百脈根為實驗材料2.2 方法 首先對崔紅敏師姐得到的4株轉LcVP1基因百脈根進行了擴繁，將百脈根切斷

5、后放入分化培養基中促進其長出叢生苗以達到擴繁增加實驗材料的目的。然后進行后續實驗。 鹽脅迫處理分別取野生型和轉基因型的1 cm莖尖轉入生根MS無激素培養基。培養基設三個鹽濃度分別為0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L，每個組合做3個重復。在鹽脅迫期間測定相關指標。2.2.2 指標測定2.2.2.1 地上部分干重在每個處理下，分別取野生型植株和轉基因的地上部分，在80 下烘干48 h，稱重。2.2.2.2 葉片相對含水量的測定葉片相對含水量（RWC）的測定采用飽和稱重法，取百脈根葉片，用無菌水沖洗后，濾紙吸干表面水分，測定鮮重（FW），然后在4的無菌水中浸泡過夜，取出用濾紙

6、吸干表面水分，稱出飽和重（TW）,最后轉到80烘干至衡重，稱得干重（DW），葉片相對含水量=（FW-DW）/(TW-DW)×100%2.2.2.3 MDA含量的測定2.2.2.3.1 MDA含量測定的原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應生成紅棕色的三甲川(3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮)，其最大吸收波長在532 nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應產物的最大吸收波長在450 nm，但532 nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測

7、定植物組織中MDATBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應物在532 nm、450 nm處的吸光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為每克干重100300 g·g1，根據植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5 mol·L-1。（1）直線回歸法 MDA與TBA顯色反應產物在450 nm波長下的吸光度值為零。不同濃度的蔗糖(025 mmol·L1)與TBA顯色反應產物在450 nm的吸光度值與532 nm和600 nm處的吸光度值之差成正相關，配

8、制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應后，測定上述三個波長的吸光度值，求其直線方程，可計算糖分在532 nm處的吸光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：Y532-0.001980.088D450 （2）雙組分分光光度計法 據朗伯一比爾定律：DkCL，當液層厚度為1 cm時，kDC，k稱為該物質的比吸收系數。當某一溶液中有數種吸光物質時，某一波長下的吸光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質的吸光度值之和。已知蔗糖與TBA顯色反應產物在450nm和532nm波長下的比吸收系數分別為85.40和7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數為0，532nm波長下的比吸收系

9、數為155，根據雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式： C111.71D450 C26.45（D532D600）0.56D450 C1：可溶性糖的濃度(mmol·L1)； C2：MDA的濃度(mol·L1)； D450、D532、D600分別代表450、532和600 nm波長下的吸光度值。2.2.2.3.2主要儀器設備 752紫外可見分光光度計；離心機；電子天平（0.0001）；研缽；2.2.2.3.3 實驗試劑10三氯乙酸(TCA)；0.6硫代巴比妥酸：先加少量的氫氧化鈉(1 mol·L1)溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。2.2.2.3.4 實

10、驗過程取各種處理的葉片0.5 g放入研缽中，加入少許石英砂和2 ml 10%的三氯乙酸（TCA）研成勻漿，將勻漿轉移到試管中，再用3 ml 10%的三氯乙酸分兩次沖洗研缽，合并勻漿，在提取液中加入5 ml 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，搖勻，然后將試管放入沸水中煮沸10 min（自試管中出現小氣泡開始記時），到時間后立即將試管放入冷水浴中，待試管冷卻后，過濾，量其體積，以0.3%的硫代巴比妥酸溶液為空白，用紫外分光光度計測450 nm，532 nm和600 nm處的吸光度值。2.2.2.3.5 結果計算按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。用雙組分分光光度法求得MDA的濃度，根據植物組織

11、的重量計算測定樣品中MDA的含量： MDA含量(mol· g-1)=MDA濃度(mol·L-1)×提取液體積(ml)植物組織鮮重(g) 3結果與分析3.1 LcVP1轉基因植株的耐鹽性高于野生植株由圖片（見附錄一）可知在沒有經過NaCl脅迫生根培養基上的野生型(WT)和轉基因型(LcVP1)植株在形態上沒有區別，但是在不同濃度的鹽脅迫下，轉基因植株綠色粗壯，而野生型植株葉黃細高。表明轉因植株教野生型植株具有較高的耐鹽性。3.2 LcVP1轉基因植株的葉片相對含水量高于野生型植株葉片相對含水量的變化能反映出植株耐鹽性和抗旱性的強弱，變化較大的植株耐鹽性和抗旱性較弱，

12、反之則較強。由圖1可以看出，在鹽脅迫期間，野生植株和轉基因植株的葉片相對含水量都呈下降趨勢，但轉基因植株葉片相對含水量的變化幅度小于野生型植株，且葉片相對含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。例如，在100 mmolL NaCl下，野生植株的葉片相對含水量下降了53，而轉基因植株僅下降了45；這說明，轉基因植株在受到鹽脅迫時具有較強的保水能力。圖1 NaCl脅迫下對野生型和轉基因型百脈根葉片相對含水量3.3 LcVP1轉基因植株的地上部分干重下降趨勢高于野生型植株地上部分干重是顯示植物生長狀況的指標之一，由圖2 可知在鹽脅迫期間，野生植株和轉基因植株的葉片相對含水量都呈下降趨勢，但轉基因植株葉片相

13、對含水量的變化幅度小于野生型植株，且葉片相對含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。在100 mmolL NaCl下，野生植株的地上部干重下降了40，而轉基因植株的地上部干重僅下降了33。這表明轉基因植株在鹽脅迫和干旱脅迫下的生長狀況要明顯好于野生植株。圖2 NaCl脅迫對野生型和轉基因型百脈根地上部干重的影響3.4 LcVP1轉基因植株的細胞膜穩定性高于野生型植株一般說來，耐鹽植株和抗旱植株細胞膜系統在鹽脅迫和干旱脅迫后受損程度較小，且主要表現在MDA含量較低，細胞膜透性較小，反之，細胞膜受損程度嚴重。在受到鹽脅迫后，野生植株和轉基因植株的MDA含量會有所增加，由圖3中數據可知，轉基因植株的增加幅

14、度較野生植株平緩，且值低于野生型。在100 mmolL NaCl脅迫的處理下，轉基因植株的MDA含量增加2.3倍，而野生型植株的MDA含量增加了2.5倍，表明轉基因植株細胞膜受損程度輕，其耐鹽性較野生型強。 圖3 NaCl脅迫對野生型和轉基因型百脈根MDA含量的影響4 討論高鹽會對植物造成離子脅迫和滲透脅迫，嚴重影響了植物正常的生理生化反應，導致植株生長緩慢甚至死亡，然而許多植物在長期鹽漬環境中會進化出一系列機制對外界高鹽脅迫，在鹽漬生境中正常生長。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害時，往往發生膜脂過氧化作用。膜脂過氧化作用的產物比較復雜，包括一些醛類、烴類等。其產物之一丙二醛(MDA) 從膜上產

15、生的位置釋放出后，可以與蛋白質、核酸反應，改變這些大分子的構型，或使之產生交聯反應，從而喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質的合成。因此，研究中常以MDA含量來反映植物膜脂過氧化的水平和對細胞膜的傷害程度。 轉基因植株不僅要進行分子檢測以確定其表型性狀，如耐鹽、抗旱、抗病、抗蟲。本研究發現，與野生型植株相比，轉基因植株的耐鹽性有所提高；隨著鹽脅迫濃度的增加，轉基因植株的MDA含量的增加較野生植株的增加平緩，葉片相對含水量的下降較野生植株的下降平緩。轉基因植株的這些優越性是因為H+-PPase的過量表達，使液泡中積累Na+增加，維持了細胞離子平衡，特別是K+和 Na+的平衡，并提

16、高了液泡的滲透能力。目前有關液泡膜V-H+-PPase對鹽脅迫的響應有以下兩種看法：一是Na+對V-H+-PPase有抑制作用，NaCl脅迫下的V-H+-PPase活性下降。Matsumoto等報道，經200 mmol/L NaCl處理的大麥根V-H+-PPase活性是對照的50，類似現象也在400 mmolL NaCl處理的冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、100 mmolLNaCl處理的綠豆中觀察到6。外源Ca2+緩解NaCl對V-H+-PPase的抑制，5mmolL外源Ca2+使100mmolL NaCl脅迫的綠豆根V-H+-PPase活性完全恢復

17、至對照的水平。另一觀點是NaCl誘導V-H+-PPase活性活性上升。Colombo等(1993)發現NaCl脅迫增加了胡蘿卜懸浮細胞的V-H+-PPase活性7。Ballesteros等發現NaCl脅迫下向日葵幼苗根中的H+-PPase活性比對照略有增加。50 mmolL NaCl處理的胡蘿卜細胞V-H+-PPase在10d內較對照增加l倍，80 mmolL NaCl處理的歐亞槭（Acer Pseudoplatanus)細胞H+-PPase也成倍增加8。比較耐鹽性不同的兩個大麥品種(鑒4和科品7號)V-H+-PPase對不同濃度NaCl(0、100、200 mmolL)的反應，發現耐鹽的鑒4

18、在兩種鹽濃度下，根系、葉片V-H+-PPase水解活性均上升，而不耐鹽的科品7號根系、葉片V-H+-PPase水解活性均下降，顯示了V-H+-PPase的基因型差異。在100和400 mmolL NaCl脅迫下，鹽地堿蓬葉片中V-H+-PPase活性較對照增加9。李平華10的研究表明，用400 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，分離其葉片液泡膜微囊進行Western blot分析發現鹽脅迫誘導了鹽地堿蓬V-H+-PPase蛋白表達并且其活性明顯增大，這與包華音11的研究結果一致。李圓圓121用100 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，其幼葉和成熟葉中V-H+-PPase的水解活性均有所增加

19、。此外，成熟葉中V-H+-ATPase的水解活性要高于幼葉，幼葉中V-H+-PPase水解活性要明顯高于成熟葉，這與V-H+-PPase在大多數的幼嫩組織中是液泡膜上主要的質子泵，而在成熟組織中V-H+-ATPase為液泡膜上主要的質子泵的觀點一致。VeraEstrella等13用200 mmolL NaCl處理鹽芥(The llungiella halophila)后，鹽芥葉片中H+-PPase水解活性是未做NaCl處理的1.3倍；Guo等14將鹽地堿蓬(Suaeda salsa) H+-PPase基因SsVP轉入擬南芥，400 mmolL NaCl處理能夠誘導轉化植株葉中SsVP的表達。包

20、愛科等3的研究表明高濃度的Na+通常會抑制V-H+-PPase的活性，而低濃度的Na+則會促進V-H+-PPase的活性或提高其轉錄水平。Na+對V-H+-PPase活性的影響可能是由于Na+競爭酶中K+結合位點而造成的15。因此V-H+-PPase可以作為衡量作物耐鹽性的一個指標。由于植物的耐鹽性是由多基因控制的復雜性狀16，因此同時過量表達多個基因可能比單個基因更能賦予轉基因植物更強的耐鹽性17。李平華的研究表明，同時過量表達鹽地堿蓬Na+H+逆向轉運蛋白基因SsNHXl及擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVPl的擬南芥植株比野生型擬南芥植株具有更強的抗鹽能力10。Zhao等17將鹽地堿蓬SsNH

21、Xl及擬南芥AVPl在水稻中同時過量表達，獲得的轉基因植株比單獨過量表達兩者之一的轉基因植株具有更強的耐鹽性； 本實驗獲得的轉基因植株是單獨過表達LcVP1基因，植株的抗鹽性的提高不是很顯著，在后續試驗中可以同時轉入多個相關外源基因，可能會有賦予轉基因植物更強的抗鹽性。5.結論在鹽脅迫期間，轉基因植株的葉片相對含水量、細胞膜穩定性、地上部分干重下降趨勢均高于野生型，綜上述表明轉LcVP1基因百脈根的抗鹽性有所提高。參考文獻1 孫艷香，楊紅梅，耿云紅，等根癌農桿菌介導的百脈根遺傳轉化體系的優化研究J.南開大學學報(自然科學版)，2006，39(2)：51-572 Maeshima M Vacuo

22、lar H+-pyrophosphataseJ.Biochim Biophys Acta. 20001465：37-513 包愛科，張金林，郭正剛，等液泡膜H+-PPase與植物耐鹽性J.植物生理學通訊,2006，42(4)：777-7834 孫艷香，王勇.百脈根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆與分析.植物生理學通訊.2007.43(4):657-6635 程 星AVP1基因轉化百脈根及其轉基因植株的耐鹽抗旱性研究 .碩士學位論文甘肅：蘭州大學，20096 Matsumoto HChung G CIncrease in proton-transport activity of tono

23、plast vesicles as an adaptive response of barley roots to NaCl stressJ.Plant Cell Physiol，1988，29(7)：1133-11407 Colombo R，Cerana REnhanced activity of tonoplast pyrophosphatase in NaCIGrown cells of Daucus carotaJ.Journal ofplant physiology,1993，142：226-2298 Ballesteros E，Donaire J P，Belver AEffects

24、 of salt stress on H+-ATPase and H+-PPase activities of tonoplastenriched vesicles isolated from sunflower rootsJ.Plant Physiol，1 996，97：259-2689 Wang B S，Luttge U，Ratajczak REffects of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPaes in leaves of the halophyte Suaeda salsaJ.Exp Bot，2001，52

25、(365)：2355-236510 李平華鹽脅迫下鹽地堿蓬液泡膜質子泵表達分析及過量表達SsNHXl-AVPI對擬南芥耐鹽性的影響博士學位論文山東：山東師范大學，200311 包華音NaCl脅迫對鹽地堿蓬根、莖、葉液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影響碩士學位論文山東：山東師范大學，200412 李圓圓KCl處理對鹽地堿蓬液泡膜H+-ATPase和H+-PPase活性的影響碩士學位論文山東：山東師范大學，200513 Vera-Estrella R，Barkla B J，et a1Salt stress in Thellungiella halophila activates N

26、a+ transport mechanisms required for salinity toleranceJ.Plant Physiol，2005，139：1507-1517.14 Guo S L，Yin H B，Zhang X，et al.Molecular cloning and characterization of avacuolar Wpyrophosphatase gene，SsVP，from the halophyte Suaeda salsa and its overexpression increases salt and drought tolerance of ArabidopsisJ.Plant Mol Biol，2006，60：41-5015 Zhen R G Kim E J，Rea P AAcidic residues necessary for pyrophosphate energized pumping a