1、 66勉揚(yáng)保力2010其等圍廣泛種植,是一種深受歡迎的蔬菜作物。近年來(lái),中國(guó)大陸從我國(guó)臺(tái)灣及日本引進(jìn)黃秋葵種植。目前,在廣東、北京、上海、山東、江蘇、浙江、海南和福建等地均有栽培。黃脈花葉病和曲葉病是黃秋葵生產(chǎn)上的主要病害。前者由黃秋葵黃脈花葉病毒(Okra yellow vein mosaic virus,OYVMV、秋葵黃脈花葉病毒(Bhendi yellow vein mosaic virus,BYVMV或墨西哥黃秋葵黃葉病毒(Okra mosaic Mexico virus, 0kMMV侵染引起;后者則由黃秋葵曲葉病毒(Okra leaf curl virus,(kLCuV、杰濟(jì)拉棉花

2、曲葉病毒(Cotton leaf curl Gezira virus,CI.CuGV或木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV等侵染引起;其中(YVMV和BYVMV是其生產(chǎn)上最主要的制約因子r1叱。上述這些病毒均屬雙生病毒科(Geminiviridae菜豆會(huì)色花葉病毒屬(Begomovirus,由于該屬病毒均由煙粉虱以持久方式傳播,因此又稱之為煙粉虱傳雙生病毒。2008年,廣東省廣州市花都區(qū)蔬菜基地發(fā)生了黃秋葵黃脈曲葉病,其癥狀與文獻(xiàn)3描述的OYVMV癥狀有差異。本文報(bào)道了對(duì)黃秋葵黃脈曲葉病樣的槍測(cè)與鑒定。l材料與方法1.1毒源材料黃秋葵黃脈

3、曲葉病樣采自廣東省廣州市花都區(qū)花東蔬菜基地。1.2病樣總DNA提取采用NaOH法H1提取病株總DNA,作為PCR 模板。1.3PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定利用煙粉虱傳雙生病毒通用簡(jiǎn)并引物AV494和CoPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,預(yù)期特異片段大小為570bp。PCR反應(yīng)體系為:lo×PCR反應(yīng)緩沖液2.5肛I。、25mmol/L MgCl21.5弘I。、10mmol/L dNTPs0.5“L、5pmol/L的3端和5端簡(jiǎn)并引物各2.5ttL、Taq酶(TaKaRa1U,上述病株總DNA (1520ng/mI,1弘I。作為模板,加雙蒸水至25弘L。94預(yù)變性4min,然后94變性1min,50退

4、火45S,72延伸45S,30個(gè)循環(huán),72最終延伸10min。反應(yīng)結(jié)束,取lo”L PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢查結(jié)果。取3個(gè)病株的PCR特異片段分別克隆到T_載體(Promega公司上,隨機(jī)選取每個(gè)病株克隆各1個(gè)進(jìn)行序列測(cè)定。1.4序列分析通過(guò)上述方法獲得570bp特異片段序列。利用美國(guó)生物技術(shù)信息中心(national center for bio-technology information,NCBl的BI。AST(basic local alignment search t001程序,對(duì)3個(gè)特異序列進(jìn)行比較及同源性檢索。2結(jié)果與分析2.1田間病株癥狀田間黃秋葵病株典型癥狀表現(xiàn)

5、為葉脈黃化,在葉片正面形成網(wǎng)絡(luò)狀,在葉背面葉脈腫大突起明顯,葉片向下卷曲,葉質(zhì)脆硬;病株幼葉癥狀明顯,葉小且向下卷曲,甚至整片幼葉黃化,而老葉癥狀不明顯或不表現(xiàn)病癥。植株若早期被感染,則表現(xiàn)矮化、植株結(jié)實(shí)少且小。在發(fā)生黃脈曲葉病的黃秋葵田間,病株率高達(dá)60%以上。a:葉脈黃化;b:葉脈腫大;c:健康葉片 圖l黃秋葵黃脈曲葉病株癥狀36卷第1期董迪等:廣東黃秋葵黃脈曲葉病樣中槍測(cè)到煙粉虱傳雙生病毒672.2PCR檢測(cè)結(jié)果利用煙粉虱傳雙生病毒特異簡(jiǎn)并引物對(duì)黃秋葵黃脈曲葉病樣進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示:從這些病樣總DNA中均能擴(kuò)增獲得1條大小約570bp的特異片段(圖2,與預(yù)期大小一致。表明這些黃秋葵

6、黃脈曲葉病樣中含有煙粉虱傳雙生病毒。1:DNA分f醋標(biāo)準(zhǔn)(100bp ladder;2:CK一;3-7:待檢測(cè)黃秋葵病樣;8:ToLCGuV(CK+l圖2黃秋葵黃脈曲葉病樣PCR檢測(cè)結(jié)果2.3特異片段的克隆及序列分析結(jié)果黃秋葵黃脈曲葉病樣的PCR特異片段克隆及序列比較結(jié)果顯示:3個(gè)片段序列完全相同。BI。AST結(jié)果表明,與該特異片段序列有同源關(guān)系的病毒均屬雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬,其中與CLCuMV-G6DNAA6的序列相似性高達(dá)99%,與CLCuMV其他8個(gè)分離物、CLCuV(8個(gè)分離物及CLCuRV-Sirsa:04的DNAA序列相似性均大于95%;而與BYVMV(4個(gè)分離物、OkYV

7、MV-201、OkLCuMV及CLCuGV-Okra/Niger的DNAA序列相似性均小于88%(表1。這些結(jié)果進(jìn)一步表明:廣東黃秋葵黃脈曲葉病樣存在煙粉虱傳雙生病毒,且該病毒與CLCuMV分離物G6高度同源。3討論本研究在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了在表現(xiàn)黃脈曲葉病的黃秋葵中檢測(cè)到煙粉虱傳雙生病毒,而且該病毒PCR特異片段與發(fā)生在同一地區(qū)侵染朱槿的CLCuMV分離物G6的DNAA相似性達(dá)99%。黃秋葵與朱槿同屬錦葵科,先前的研究表明,廣東多個(gè)地區(qū)的朱槿已遭受CLCuMV的嚴(yán)重危害s-63,而發(fā)生黃秋葵黃脈曲葉病的菜區(qū)周邊朱槿曲葉病也嚴(yán)重發(fā)生;同時(shí),該病毒傳播介體煙粉虱在該地區(qū)普遍存在。因此推測(cè),廣東黃秋葵

8、黃脈曲葉病很可能是由CLCuMV朱槿株系侵染所致。作者正在克隆該病毒分離物的全基因組并構(gòu)建侵染性克隆加以驗(yàn)證。由于廣東的黃秋葵病株表現(xiàn)為葉脈黃化、葉脈腫大、花葉和曲葉等癥狀,所以稱之為黃秋葵黃脈曲葉病。但PCR特異片段序列比較結(jié)果顯示,該病毒與國(guó)外報(bào)道的侵染危害黃秋葵的0YVMV、BYVMV、0kI。CuMV和CLCuGV等相似性均小于88%(表1,說(shuō)明該病毒分離物明顯不同于目前世界上已報(bào)道的危害黃秋葵的煙粉虱傳雙生病毒。至于廣東黃秋葵黃脈曲葉病是否僅由CLCuMV朱槿株系侵染引起,還是存在其他病毒或復(fù)合侵染引起,尚需要做進(jìn)一步研究。表1與廣東黃秋葵中煙粉虱傳雙生病毒DNA相似性較高的Bego

9、movirus病毒分離物¨1CLCuMV:木爾坦棉花曲葉病蓐(Cotton leaf curl Multanvirus;ClfuV:棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl virus;CLCuRV:拉賈基妞棉花曲葉病毒(cotton leaf curl Rajasthan virus;0YVMV:黃秋葵黃脈花葉病(Okrayellowvein?rlosaicvirus;BY、,MV:秋葵黃脈花葉病毒(Bhendi yellow vein mosaic virus;CLCuGV:杰濟(jì)拉棉花曲ut病毒(Cotton leaf curl Gezira virus;okLCuMV:馬

10、里黃秋葵曲葉病毒(Okra leaf curl Mali virus。目前,世界上報(bào)道可引起棉花曲葉病的至少有6種,包括CLCuMV、CIuGV、CLCuRV、Cotton lea廠crumple viru5(CI.CrV、Cotton lea f curl Alabad viru5(CIuAV和Cotton lea f curl Kokhran virus(CLCuKV81,其中CLCuMV和CLCuGV的 廣東黃秋葵黃脈曲葉病樣中檢測(cè)到煙粉虱傳雙生病毒作者:董迪, 何自福, 柴兆祥, Dung Di, He Zifu, Chai Zhaoxiang作者單位:董迪,Dung Di(甘肅農(nóng)業(yè)大

11、學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州,730070;廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣州,510640, 何自福,He Zifu(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣州,510640, 柴兆祥,Chai Zhaoxiang(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州,730070刊名: 植物保護(hù)英文刊名:PLANT PROTECTION年,卷(期:2010,36(1被引用次數(shù):0次參考文獻(xiàn)(9條1.Ali M.Hossain M Z.Sarker N C Inheritance of Yellow vein mosaic virus(YVMVtolerance in a cultivar of okra(Abelmoschus e

12、sculentus(LMoench 20002.Jose J.Usha R Bhendi yellow vein mosaic disease in India is caused by association of a DNA satellite with a Begomovirus 2003(23.Sastri K S M.Singh S J Effect of Yellow vein mosaic virus infection on growth and yield of okra crop 1974(34.劉玉樂(lè).蔡健和.李冬玲中國(guó)番茄黃化曲葉病毒-一個(gè)雙生病毒新種 1998(25.

13、何自福.毛明杰.虞皓朱槿曲葉病樣中煙粉虱傳雙生病毒的分子檢測(cè) 20076.毛明杰.何自福.虞皓.李華平侵染朱槿的木爾坦棉花曲葉病毒及其衛(wèi)星DNA全基因組結(jié)構(gòu)特征期刊論文-病毒學(xué)報(bào) 2008(17.Zhou Xueping.Liu Yule.David J Four DNA-A variants among Pakistani isolates of Cotton leaf curl virus and their affinities tO DNA-A of geminivirus isolates from okra 19988.Wauquet C M.Stanley J Revising the way we conceive and name viruses below the species level:A review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors 20059.Harrison B D.Li