1、Cdk2在皮膚淋巴瘤中的表達及統計分析【摘要】 目的：探討Cdk2在皮膚淋巴瘤中的表達及其在腫瘤的發生和發展中的作用。方法: 收集武漢大學人民醫院病理科20062009 年手術切除及活檢經病理明確診斷的皮膚淋巴瘤蠟塊40 例, 其中22 例MF、7 例皮膚間變性大細胞淋巴瘤、6 例其他類型的T 細胞淋巴瘤、5 例B 細胞淋巴瘤。另外20例皮膚炎癥病變,包括10例銀屑病、10例副銀屑病。采用免疫組織化學方法觀察各組組織內Cdk2的表達。利用HPIAS2000圖像分析系統測定Cdk2在以上各組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結果：皮膚淋巴瘤中Cdk2呈高表達;癌旁組織中Cdk2呈低表達。圖像分

2、析結果顯示：皮膚淋巴瘤與皮膚炎癥病變之間Cdk2的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05)。結論：Cdk2異常高表達促進細胞增殖,從而在皮膚淋巴瘤發病過程中起重要作用。 【關鍵詞】 皮膚淋巴瘤; Cdk2; 免疫組織化學; 圖像分析在惡性淋巴瘤與假性淋巴瘤的淋巴結外病變中, 皮膚是最常受侵犯的器官, 雖然皮膚淋巴瘤在某些方面比較特殊, 但仍屬于淋巴瘤一類疾病,皮膚淋巴瘤是僅次于胃腸道的第二常見的淋巴結外淋巴瘤1，2。細胞周期與腫瘤發生、發展有密切關系,細胞周期的動態過程有賴于正、負調節因子控制。細胞周期素依賴性激酶(cyclindependent kinase,

3、Cdk)在細胞分化、有絲分裂中起促進作用3，4。為探討Cdk2 與皮膚淋巴瘤的發生發展的關系及臨床意義,本文采用免疫組化的方法對皮膚淋巴瘤中Cdk2表達情況進行了檢測,以期為皮膚淋巴瘤的早期診斷和治療提供參考指標。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 材料來源 收集武漢大學人民醫院病理科2006年2009 年手術切除及活檢經病理明確診斷的皮膚淋巴瘤蠟塊40 例, 其中22 例蕈樣肉芽腫(MF)、7 例皮膚間變性大細胞淋巴瘤、6 例其他類型的T 細胞淋巴瘤、5 例B 細胞淋巴瘤。另外20例皮膚炎癥病變,包括10例銀屑病、10例副銀屑病。1.1.2 材料分組 將所有標本進行常規HE染色,將實驗分為

4、2組: 皮膚淋巴瘤組和皮膚炎癥病變組。1.2 方法1.2.1 常規脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色1.2.2 免疫組織化學SP法檢測Cdk2相關抗原具體步驟： 4m組織切片常規脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min; 滴加3%過氧化氫，37濕盒孵育10min以抑制內源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 正常羊血清37濕盒孵育10min以減少非特異性背景; 甩去多余血清，分別滴加一抗，4孵

5、育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min; 滴加生物素標記的二抗37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物復合物37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min; 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間(約35 min)，自來水沖洗終止反應; 蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍; 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢; 用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為Cdk2的陽性對照組。1.2

6、.3 免疫組織化學結果判斷Cdk2以細胞核或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(同濟千屏影像公司)對Cdk2的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400) ,測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積,計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.3 統計學處理數據以均數±標準差表示，用SPSS12.0

7、軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗,檢驗水準為0.05。2 結果皮膚炎癥病變組: 皮膚炎癥病變內可見少量的棕黃色顆粒, Cdk2表達弱或無表達;皮膚淋巴瘤組: 皮膚淋巴瘤內可見密集分布的棕黃色顆粒，Cdk2表達強。圖像分析結果顯示：皮膚炎癥病變組Cdk2表達的平均光密度和陽性面積率分別為0.0458±0.0015和0.0297±0.0019;皮膚淋巴瘤組Cdk2表達的平均光密度和陽性面積率分別為0.7831±0.0069和0.7436±0.0060。皮膚炎癥病變組與皮膚淋巴瘤組Cdk2比較,差異

8、有顯著性意義(P<0.05)。見表1。表1 皮膚炎癥病變組與皮膚淋巴瘤組Cdk2表達的平均光密度和陽性面積率3 討論惡性淋巴瘤(ML ) 是淋巴結或結外部位淋巴組織的免疫細胞腫瘤, 一般分霍奇金淋巴瘤(HL ) 和非霍奇金淋巴瘤(NHL ) 兩大類。在惡性淋巴瘤與假性淋巴瘤的淋巴結外病變中, 皮膚是最常受侵犯的器官, 雖然皮膚淋巴瘤(Cutancous Lylmphoma，CL)在某些方面比較特殊, 但仍屬于淋巴瘤一類疾病57。細胞周期受細胞精確和有序的調控。細胞周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴性激酶(cyclindependent kinase,CDK)是細胞周期調控中的

9、關鍵大分子。周期蛋白依賴性激酶亞型按數字命名,包括CDK2CDK7。由于細胞分裂周期蛋白(CDC)2曾被命名為CDK1,因此CDK類排序自CDK2始。CyclinECDK2為細胞從G1進入S期的關鍵激酶復合物810。周期蛋白E與CDK2結合后,磷酸化其底物蛋白。但CyclinECDK2的激酶活性是受到嚴格調控的。DNA作為遺傳物質必須被準確地復制到子代細胞中,當DNA受到損傷和出現錯誤時,其復制是不被允許的11,12。CDK2存在于整個細胞周期中,是cyclinE 的催化亞基,而cyclinE 是CDK2 的調節亞基,其與CD K2 結合形成一活性復合物并使CD K2 激活,可促使細胞由G1期

10、進入S 期。cyclinE 過高表達使CDK2 持續激活,細胞周期調節失控而異常增生13,14。Cdk2活性增高,可以促進細胞演進、增殖、分化,是細胞周期的正調節因子。本實驗結果顯示: Cdk2在皮膚淋巴瘤中呈高表達,表明Cdk2在皮膚淋巴瘤的演變過程中發揮細胞周期正性調節因子的促進作用,使癌細胞惡性程度和侵襲力增加。結果表明, CDK2在皮膚淋巴瘤發病機制中的作用是肯定的。cyclinE 和CDK2 的異常表達已在多種惡性腫瘤中被報道,其中包括乳腺癌、子宮內膜癌、宮頸癌等,其在臨床上作為一種診斷及判斷預后指標或聯合指標, 可輔助臨床工作者的診治工作。【參考文獻】 1Leroy S , Dub

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