1、BTLA 在T細胞上的表達和功能 作者：王月穎,王雪峰, 張學光, 顧宗江【摘要】 目的: 研究BTLA（B and T lymphocyte attenuator）在T細胞上的表達和功能。方法: 分離純化人外周血T細胞, 流式細胞術檢測BTLA在不同T細胞亞群上的表達。進一步用CD3抗體分別和游離、 包被以及抗Fc段二抗交聯的BTLA激發單克隆抗體（mAb）或HVEMFc融合蛋白共同刺激T細胞活化, MTT檢測細胞增殖。結果: BTLA組成性表達于CD3+、 CD4+和CD8+T細胞表面。游離的BTLA mAb和HVEMFc融合蛋白均不能抑制CD3刺激的T細胞增殖, 然而包被和交聯后的BTL

2、A mAb和HVEMFc融合蛋白則能夠明顯抑制T細胞增殖。結論: BTLA的活化能顯著抑制CD3抗體所活化的T細胞的增殖。 【關鍵詞】 BTLA; 共刺激分子; 抑制; T細胞T細胞的活化依賴于雙信號的共同刺激。T細胞受體（TCR）識別抗原提呈細胞（APC）上抗原肽MHC復合體, 啟動了T細胞活化的第一信號; APC上共刺激分子與T細胞膜上相應受體結合則提供了T細胞活化的第二信號。第二信號既包括增強T細胞反應的正性信號, 也包括抑制T細胞反應的負性信號。CD28是促進T細胞初始活化的重要共刺激分子, 能夠增進IL2的合成, 維持T細胞反應; 與之相反, CTLA4抑制T細胞活化, 然而, 它們

3、都與表達在APC表面的B71和B72結合1。CD28家族另外一個刺激分子ICOS與B7h結合, 增強效應T細胞的反應2。PD1是繼CTLA4之后發現的負性共刺激分子, 具有兩個配體PDL1和 PDL23。BTLA（B and Tlymphocyte attenuator）是CD28家族新近發現的負性共刺激分子4。BTLA-/- T細胞對CD3mAb刺激的增殖較野生型T細胞更敏感5。與其他家族成員不同, BTLA的配體不屬于B7家族成員, 而是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的HVEM6。值得一提的是, HVEM與TNF家族配體LIGHT結合能增強T細胞活化7, 然而, HVEM與BTLA結合卻

4、產生抑制T細胞的作用8, 因此HVEMBTLA是一對比較特殊的信號分子。1 材料和方法1.1 材料淋巴細胞分離液Ficoll(上海生化試劑二廠); 96孔細胞培養板（Costar公司）; RPMI1640培養基（Gibco公司）; 胎牛血清FCS（杭州四季青公司）; 激發型CD28 mAb和BTLA mAb 8H9均為本室自行研制; CD3激發型抗體（Beckman Coulter）; 人HVEMFc融合蛋白（R&D公司）; PE標記鼠抗人BTLA抗體（eBioscience）; FITC標記鼠抗人CD4和CD8抗體（eBioscience）; 羊抗鼠Fc段抗體和羊抗人Fc段抗

5、體（crosslink 抗體, Bethyl公司）; 人T細胞陰性分選試劑盒（StemCell Technologies）。二氧化碳培養箱（Jouan公司）; 流式細胞儀（BeckmanCoulter公司）。1.2 方法1.2.1 外周血T細胞分離及純化采集健康志愿者外周全血, 經Ficoll密度梯度離心獲得外周血單個核細胞（PBMC）, 進一步按人T細胞陰性分選試劑盒說明書方法, 磁珠分離T細胞, 檢測 T細胞純度 96%。1.2.2 流式細胞檢測BTLA在T細胞的表達分離純化的T細胞用PBS洗滌后重懸于100L PBS中, 加入PE標記鼠抗人BTLA抗體、FITC標記鼠抗人CD4、CD8抗

6、體, 4作用30 min, 洗滌后上流式細胞儀檢測。1.2.3 T細胞的活化 用CD3抗體分別和不同濃度的8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG共同包被96孔板, 4過夜,用PBS洗滌; 或CD3抗體包被過夜后加入不同濃度的游離8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG。將分離純化的T細胞密度調整為1×109/L, 每孔加入100L。在抗體交聯實驗中, 96孔板CD3抗體包被過夜后, 加入不同濃度的游離8H9、人HVEMFc融合蛋白及對照IgG, 繼而加入T細胞, 置于37、50 mL/LCO2培養箱中孵育1 h, 然后加入抗Fc段抗體, 37、50 mL/L CO2培養箱中繼續

7、培養。1.2.4 T細胞增殖檢測刺激活化的T細胞培養3d, 于培養的最后4h加入20L MTT溶液（5g/L）繼續培養, 吸取上清, 加入100L酸化異丙醇徹底溶解結晶, 用酶標儀A570波長比色。1.2.5 統計學分析數據用平均值x±s表示。兩組樣本均數的比較采用t檢驗, 以P<0.05 為有統計學意義。2 結果2.1 BTLA在靜止T細胞上的表達流式細胞術檢測顯示, BTLA組成性表達于靜止T細胞上。大約84% CD3+T細胞上表達BTLA, CD4+T上的表達高于CD8+T, 表達量分別是87%和77%（圖1）。2.2 BTLA mAb 8H9對T細胞增殖的影響B

8、TLA的胞內區包含2個免疫受體酪氨酸抑制性基序(ITIM), 基序中的酪氨酸磷酸化后, 可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2, 發揮抑制作用4。我們用CD3抗體包板, 聯合BTLA mAb 8H9共同刺激純化T細胞。結果表明, 游離的8H9不能抑制T細胞的增殖。然而, 8H9與CD3抗體一起包板后, 和對照抗體相比, 明顯產生抑制T細胞增殖的作用（P<0.05）, 并且抑制效果具有濃度依賴性（圖2A）。以前的研究表明, mAb與微球相偶聯, 可以在液相中發揮作用9。本實驗在CD3和游離8H9刺激的T細胞中加入針對Fc的二抗, 對8H9 mAb進行交聯, 結果表明8H9經過交聯后

9、, 能明顯抑制T細胞的增殖（P<0.05）, 并且與包板的8H9相似, 隨著濃度的增加, 抑制作用更明顯（圖2B）。2.3 HVEMBTLA通路抑制T細胞增殖表達在T細胞上的HVEM與其配體LIGHT結合, 可以促進T細胞的活化, 而與BTLA結合, 則通過后者傳遞抑制信號。實驗中利用HVEMFc融合蛋白來研究HVEMBTLA這對信號分子對T細胞的影響。與8H9相同, 包被固定的HVEMFc可產生抑制作用, 而游離的HVEMFc不能抑制CD3活化的T細胞增殖（圖3A）。當用抗Fc抗體將HVEMFc融合蛋白交聯后, 亦能明顯抑制T細胞增殖（P<0.05, 圖3B）,

10、并且HVEMFc融合蛋白在CD3抗體小于0.5 mg/L時抑制效果最好（P<0.05, 圖3C）。3 討論 BTLA是CD28家族發現的第3個抑制性共刺激分子。與CTLA4和PD1相似, BTLA分子的酪氨酸經誘導磷酸化后, 可以招募SHP1和SHP2, 產生抑制信號, 阻礙T細胞的活化4。我們的研究表明, BTLA組成性高表達于初始T細胞表面。與此不同, CTLA4和PD1僅誘導表達于活化T細胞表面1, 由此推測這些分子可能在T細胞免疫應答的不同階段發揮作用。 共刺激分子在免疫應答的各個階段都起著非常重要的作用。以往利用共刺激分子配體的Fc融合蛋白進行研究時, 需將Fc融合蛋白

11、包被固定在培養板上, 才能發揮作用。當Fc融合蛋白未固定, 而在液體中處于游離狀態時, 就無法對共刺激分子發揮作用7。在利用針對共刺激分子的mAb進行研究時, 也會遇到相同的問題, 即大部分mAb需要包被固定在板上, 才起作用。如果mAb游離在液體中, 就起不到有效的作用。這為研究共刺激分子在免疫應答各個階段的不同時相的作用, 帶來許多困難和不便。還有研究發現將mAb與微球通過化學方法偶聯在一起, mAb就可以在液相中發揮作用9。但mAb與微球的偶聯則帶來了操作上的繁瑣與不便。在本實驗中, 我們針對在液相中處于游離狀態的mAb或Fc融合蛋白, 加入抗Fc段的抗體, 將mAb或Fc融合蛋白上的F

12、c段進行交聯（crosslinking）, 起到了加強mAb或Fc融合蛋白的作用, 使其在液相游離狀態下, 亦能起到有效的作用。此方法簡便易行, 容易控制。由于BTLA與其他兩個負性共刺激分子CTLA4和PD1的表達時相有所不同, 因此, 在采用上述交聯方法后, 我們對BTLA在免疫應答不同時相的作用, 分別進行了研究, 取得了有意義的結果, 將另文發表?！緟⒖嘉墨I】 1Coyle AJ, GutierrezRamos JC. The expanding B7 superfamily: increasing complexity in costimulatory signals regulat

13、ing T cell functionJ. Nat Immunol, 2001, 2(3): 203-209.2Tafuri A, Shahinian A, Bladt F, et al. ICOS is essential for effective Thelpercell responsesJ. Nature, 2001, 409(6816): 105-109.3Latchman Y, Wood CR,Chernova T, et al. PDL2 is a second ligand for PD1 and inhibits T cell activationJ. Nat Immunol

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