1、高效液相色譜法測定蛹蟲草子實體中腺苷的含量(一)    【摘要】 目的 建立測定蛹蟲草子實體中腺苷含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm,5m）;流動相:水甲醇（體積比8515），流速:1.2 mL/min；檢測波長:260 nm。 結果 腺苷平均加樣回收率為100.23，RSD=1.43%。結論 該方法簡便、準確，適用于該產品質量檢驗分析。 【關鍵詞】 高效液相色譜法；蛹蟲草子實體；腺苷Abstract:Objective To establish an HPLC method for

2、 content determination of adenosin in Cordyceps militaris(L.) Link. Methods Samples were analyzed on a DiamonslTM C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 m) by using watermethanol (8515) as mobile phase. The detection wavelength was 260 nm. Results The average recovery of adenosine was 100.23% with RSD=

3、1.43%. Conclusion The method is simple, accurate, which can be used for the quality control of Cordyceps militaris (L.) Link.Key words:HPLC; Cordyceps militaris (L.) Link; adenosine蛹蟲草(又名北蟲草、北冬蟲夏草)子實體為麥角菌科蟲草屬真菌蛹草菌Cordyceps. militaris( L. ) Link.的干燥子座,是蟲草屬的模式種，也是與冬蟲夏草極為相似的種。研究資料表明，蛹蟲草子實體的活性成分與野生冬蟲夏草類

4、似，含有多量的蟲草素、腺苷、腺嘌呤、蟲草酸、蟲草多糖等1-3。有文獻報道，腺苷可減少心肌漏出酶,維持細胞膜的完整性并降低冠脈阻力,對心肌有一定的保護作用4-6。目前，蛹蟲草子實體的質量多以測定其多糖的含量作為控制標準，多糖測定使用硫酸酚法，操作誤差大，條件不易把握。鑒于腺苷為蛹蟲草中的活性成分之一,本文采用高效液相色譜法測定了蛹蟲草子實體中腺苷的含量,方法靈敏，結果準確可靠。1 儀器與材料1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀ClassLCIOA型，SPD10A紫外檢測器， N2000色譜工作站；sartorius BS423S型電子天平；超聲波清洗器(天津恒奧超聲波清洗器)。1.2 材料 腺苷

5、對照品（中國藥品生物制品檢定所檢定，批號：879200102）；蛹蟲草子實體，購于江門市新會會城匯康蟲草制品廠；甲醇為色譜純；水為雙蒸水。2 方法與結果2.1 色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱DiamonsilTM C18（ 4.6 mm×250 mm,5 m ）；流動相：水甲醇（體積比8515）為流動相。流速1.2 mL/min；檢測波長：260 nm；進樣量：20 L；柱溫：室溫25 。2.2 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的腺苷對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加體積分數為90%的甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL中含0.2 mg對照品的溶液，搖勻，即得。2.

6、3 供試品溶液的制備 稱取蛹蟲草子實體樣品適量，粉碎，過2號篩，備用。精密稱取10 g供試品粉末，置500 mL圓底燒瓶內，加入體積分數為50%的乙醇水溶液100 mL，置沸水浴中回流提取1 h，取出過濾，共提取3次，濾液合并后蒸干，加體積分數為50的甲醇溶解定容至100 mL容量瓶，搖勻，經0.45 m微孔濾膜壓濾，得供試品溶液。2.4 最大吸收波長的選擇 取腺苷對照品和供試品溶液適量，加體積分數為90%的甲醇溶解，用紫外可見分光光度計于200400 nm波長范圍掃描。腺苷對照品和供試品溶液均在260 nm處有最大吸收。結果同中國藥典中“冬蟲夏草”腺苷的最大吸收波長一致。因此確定測定波長為2

7、60 nm。2.5 線性關系的考察精密吸取0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL的腺苷對照品溶液（每1mL中含0.2 mg對照品），分別置10 mL的容量瓶中，用體積分數為90的甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液，在上述色譜條件下，分別注入液相色譜儀(進樣量20 L)。以質量濃度為橫坐標(, mg/mL),峰面積(A)為縱坐標,繪制標準曲線。經回歸處理后得標準曲線：A70472098845（R2=0.9996），說明腺苷在82.56206.4 g范圍內線性關系良好。2.6 精密度試驗取16 g/mL的對照品溶液，每次進樣20 L，連續進樣5次，測定峰面積，腺苷峰面積RSD為0.41%（n

8、=5）。2.7 穩定性試驗精密吸取供試品溶液20 L，分別于放置0、2、4、6、8 h進樣測定，結果供試品溶液在8 h內峰面積無明顯變化，峰面積RSD為0.66%。2.8 加樣回收率試驗采用加樣回收法, 取已知含量的同一批供試品粉末約10 g,共5份，分別精密稱定，置圓底燒瓶中，再分別精密加入“2.2”項下腺苷的對照品溶液1 mL，再加入體積分數為50%的乙醇100 mL, 按“2.3”項下方法制備溶液,進樣測定，計算回收率，結果見表1。表1 腺苷加樣回收率試驗（略）Tab.1 Results of recovery test2.9 樣品的測定取5個不同批次的樣品各10 g,分別按“2.3”項

9、下方法制成供試品溶液，進樣20 L，測定峰面積，每個樣品測5次，結果5個批號樣品的腺苷含量分別為1.86、1.962、1.918、2.067、2.018 mg/100 mL。腺苷對照品與樣品色譜圖見圖1、圖2。圖1 腺苷對照品色譜圖（略）Fig.1 HPLC spectrum of adenosine圖2 樣品色譜圖（略）Fig.2 HPLC spectrum of the sample3 討論3.1 流動相的選擇 曾采用中國藥典2005年版一部“冬蟲夏草”項下磷酸鹽緩沖液(pH 6. 50)甲醇( 體積比173) 為流動相進行洗脫，結果發現腺苷色譜峰展寬嚴重，且主峰附近存在干擾峰。經反復實驗

10、摸索,調節流動相水甲醇體積比為8515時,采用本文的檢測方法產生的色譜峰峰形尖銳，供試品中其他雜質峰對兩個主峰測定無干擾。經方法學考察，本文檢測方法的精密度、重現性、穩定性均良好。32 提取溶劑的選擇 曾采用蒸餾水、體積分數為50%的乙醇、無水乙醇、體積分數為50%的甲醇進行提取溶劑對照試驗，實驗結果表明：體積分數為50%乙醇即可基本提取完全。在制備腺苷對照品儲備液時，曾采用雙蒸水、無水甲醇、體積分數分別為50%和90%的甲醇作溶劑，腺苷在以上溶劑均可溶解，以在雙蒸水中溶解速度最快；上高效液相色譜儀進行對比，又以在體積分數為90%甲醇中的峰形較對稱，效果最佳。33 溶液的穩定性試驗表明，腺苷供試品溶液在室溫下24 h內基本穩定，但色譜峰峰面積有逐漸降低的趨勢，可能是降解所致。故對照品溶液和供試品溶液均不宜久貯。【參考文獻】1 楊春澎.藥用植物學M.上海:上海科學技術出版社,1997:144-145.2 毛跟年，許牡丹.功能食品生理特性與檢測技術M.北京:化學工業出版社,2004:58-63.3 彭國平，衰永泰.冬蟲夏草與人工蛹蟲草的成分比較J.南京中