1、質粒提取原理和方法質粒提取原理和方法質粒DNA提取的原理及方法堿裂解法質粒DNA提取原理質粒DNA提取主要包括以下幾個方面：如何將細 胞裂解釋放質粒DNA如何將質粒DNA和基因組 DNA分離開來，如何去除RNA虧染，如何去除蛋 白質和其它雜質。質粒提取方法中，最常用的方法是堿裂解法，它 具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點。 其原理是：強堿性條件下，質粒DNA和基因組DNA同時從細 胞中釋放出來，并發生變性。在 pH中性，并有 高鹽濃度存在的條件下，質粒DNA會迅速發生復 性，仍為可溶性狀態，染色體DNA之間交聯形成 不溶性網狀結構，在去垢劑SDS乍用下，染色體 DNA與變性蛋白質和細胞碎

2、片結合形成沉淀，通 過離心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提進一步純化 質粒DNA用異丙醇或乙醇沉淀可將之純化出來。 BIOMIGA公司質粒DNA純化系列試劑盒，采用堿 裂解法質粒提取原理，在高鹽環境下，采用硅膠 膜特異性的吸附質粒DNA而蛋白質不被吸附， 最后用低鹽洗脫液將DNA從膜上洗脫下來，方法 簡單，快速，質量好，收獲量高。影響質粒提取的因素影響質粒提取的因素有很多種，如質粒拷貝數， 宿主菌株的種類，細菌的培養時間、培養基種類、 培養條件等等。質?？截悢蒂|粒DNA最終收獲量取決于質粒的拷貝數和質 粒的大小。BIOMIGA公司質粒DNA提取系列試劑 盒，操作步驟適用于高拷貝數質粒的純化，對于低拷

3、貝質粒純化提取，應加大起始菌液量的體 積，并且相應地增加各種緩沖液的用量。下表給出一些常用質粒載體的拷貝數：質粒種類復制起點拷貝數1 mL菌液質粒DNA攵獲量（卩g）pSCIOIpSCIOI5pACYCP15A10-12pSuperCos pMB1 10-200.4-1pBR322 pMB1 15-200.6-1pGEMRMuted pMB1 300-4006-7pBluescriptRColE1300-5006-8 pUCMuted pMB1500-7008-12宿主菌株宿主菌株的種類將會影響質粒的收獲量。 含內源 核酸酶的宿主菌株，如 JM101, JM110, HB101,TG1以及它們

4、的衍生菌株，通常因為內源核酸酶 的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的 作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到 的質粒容易降解，推薦客戶將質粒轉化至不含內 源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進行質 粒純化。如果從含內源核酸酶的宿主菌株中純化質粒 DNA請用試劑盒附送的核酸酶去除溶液，去除 核酸酶的污染?；蜻x用HP系列試劑盒進行質粒 的純化。下表給出一些常用的宿主菌株種類：EndA- Strains of E. ColiDH5aDH1DH21JM106JM109SK2267SRBXLOTOP10DH10BJM103JM107SK1590MM294Stbl2 ?XL1-Blue

5、BJ5182DH20JM105JM108SK1592Select96 ?Stbl4 ?XL10-GoldEn dA+ Strai ns of E. ColiC600JM110RR1ABLE? CCJ236KW251P2392BL21(DE3)HB101TG1TB1ABLE? KDH12SLE392PR700BL21(DE3) pLysSJM101JM83TKB1HMS174ES1301M1061Q358BMH 71-18All NM strai nsAll Y strai ns菌液培養BIOMIGA公司質粒DNA提取系列試劑盒，標準操 作適用于在LB培養基中培養1216小時，OD600 在2.

6、03.0的菌液質粒DNA勺提取。如果使用豐 富培養基，如TB, 2 x YT培養基，請保證 OD600 不超過3.0。菌液過量，將會影響最終的收獲量 和純度。培養方式如果用于質粒小提，請從固體培養基平板上挑取 新鮮單菌落，接種到加入篩選抗生素的培養基 中，震蕩培養1216小時。如果用于中提、大提或超大提，請按照以下方式 制備菌液：挑取單克隆，接種到15mL培養基中，進行初搖， 然后按照1:1000的比例進行放大培養，培養瓶 中培養基的體積最好不要超過培養瓶的 1/4體 積?？股貪舛鹊倪x擇對含有抗性的質粒載體，在進行篩選或培養時應 加入相應的抗生素。各種抗生素的工作濃度請參照下表：抗生素溶解性

7、保存條件嚴緊型質粒松弛型質粒 氨芐青霉素50 mg/mL（溶于水）-20 °C20 卩 g/mL60 卩 g/mL羧芐青霉素50 mg/mL溶于水-20 C20 卩 g/mL60 卩 g/mL氯霉素34 mg/mL溶于無水乙醇-20 C25 卩 g/mL170 1 g/mL卡那霉素10 mg/mL溶于水-20 °C10 1 g/mL50 i g/mL鏈霉素10 mg/mL溶于水-20 C10 i g/mL50 i g/mL四環素5 mg/mL溶于無水乙醇-20 C10 i g/mL50 i g/mL質粒質量鑒定純化到的質粒DNA一般可以通過以下三種方式 進行質量鑒定。瓊脂糖凝膠電泳檢測 理想條件下，經堿裂解法純化到的質粒 DNA應 該只出現超螺旋一條帶。但在質粒提取過程中機 械力，強堿溶液的作用等原因，純化到的質粒常 常會出現三條帶，甚至有時候會出現四條帶 （變 性超螺旋），不管是哪種形式的超螺旋，經單酶 切后，呈現一條帶，則說明提取結果正常，沒有 基因組污染。酶切鑒定純化到的質粒，進行進一步的酶切操作，鑒定質 粒的大小。紫外分光光度計檢測純化到的質粒，稀