1、第三章 生物材料的預(yù)處理、細(xì)胞破碎和液-固分離 第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理 第二節(jié) 細(xì)胞破碎 第三節(jié) 液-固分離第一節(jié) 生物材料的預(yù)處理 一、確定預(yù)處理方法的依據(jù) 二、動(dòng)物材料的預(yù)處理 三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理 1. 生物活性物質(zhì)存在方式與特點(diǎn) 胞外： 多數(shù)微生物酶如淀粉酶、蛋白酶、糖化酶常大量存在于胞外培養(yǎng)液中。而合成酶類、代謝酶類、遺傳物質(zhì)和代謝中間物則存在于細(xì)胞內(nèi)，如DNA聚合酶、細(xì)胞色素C等。 微生物酶是指起著催化作生物體系中特定反應(yīng)的、由微生物活細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。作為催化劑的微生物酶，它可以加速三種反應(yīng)：水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)和合成反應(yīng)。一、確定預(yù)處理方法的依據(jù) 1. 生物活性物質(zhì)存在特點(diǎn)生

2、物活性物質(zhì)存在特點(diǎn) 組成復(fù)雜，含量低（見后頁) 分離純化難: 目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度、 分子量、等電點(diǎn)等都十分接近，所以分離、純化比較困難。 容易失活（1） 胰島素是治療糖尿病的特效藥， 胰島素是治療糖尿病的特效藥，長(zhǎng)期以來只能依靠從 豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，胰島素在胰臟中的含量為0.02，100Kg胰腺只能提取只能提取4-5g （50-60），其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。 將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題， 1982年美國一家公司用基因工程手段生產(chǎn)胰島素，生產(chǎn)成本降低30-50%。 （

3、2） 人類的生長(zhǎng)激素是由191個(gè)氨基酸相連、分子量約22000的一種蛋白質(zhì)。這種激素在幼年時(shí)分泌不足造成侏儒癥，分泌過多造成巨人癥，成年時(shí)分泌過多導(dǎo)致肢端肥大癥等。過去從死人腦垂體提取作藥用，治療一個(gè)侏儒病人約需600具尸體的腦垂體，量少價(jià)昂。1979年美國一家基因公司成功地把人的基因移入大腸桿菌生產(chǎn)出生長(zhǎng)激素，每升工程菌液含生長(zhǎng)激素2.4mg，治療一例病人只需100多升菌液。目前已開始人工生產(chǎn)并進(jìn)入臨床應(yīng)用試驗(yàn)。 2.后續(xù)操作的要求 一般要求：濾液澄清、pH 適中、有一定的濃度 不同后續(xù)操作有不同的要求 離子交換-高價(jià)無機(jī)離子、澄清度等嚴(yán)格控制 溶劑萃取-蛋白質(zhì)含量較低，防乳化3.目的物穩(wěn)定

4、性 不穩(wěn)定的：要防失活 青霉素-pH4.8-5.2，低溫 蛋白類-高級(jí)結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定的：可采用較劇烈的變性和處理?xiàng)l件，沉淀雜質(zhì)蛋白. 如：鏈霉素，1943年美國 S.A.瓦克斯曼從鏈霉菌中析離得到，是繼青霉素后第二個(gè)生產(chǎn)并用于臨床的抗生素。它的抗結(jié)核桿菌的特效作用，開創(chuàng)了結(jié)核病治療的新紀(jì)元。 鏈霉素穩(wěn)定性較好，可在 pH 2.83.2，75加熱處理，提高過濾速度。鏈霉素為白色無定形粉末，有吸濕性。易溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。二、動(dòng)物材料的預(yù)處理 絞肉機(jī)絞碎:提取蛋白質(zhì)和酶 勻漿和組織搗碎:一些胞內(nèi)產(chǎn)物不能有效地提取，須通過特殊的勻漿才行。在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織

5、搗碎器，工業(yè)上可用高壓勻漿泵。三、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理為什么需要預(yù)處理？ 可溶性粘膠狀物質(zhì)：雜蛋白、不溶性多糖等 粘度增加、影響提取操作粘度增加、影響提取操作 無機(jī)鹽 在采用離子交換提取時(shí)，會(huì)影響樹脂對(duì)生化在采用離子交換提取時(shí)，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。物質(zhì)的交換容量。（1）加入凝聚劑 凝聚作用： 指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴(kuò)散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程。 某些無機(jī)鹽可使細(xì)胞、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等膠體顆粒發(fā)生凝聚作用而被去除。1. 細(xì)胞及蛋白質(zhì)的處理 膠體粒子穩(wěn)定的原因： 帶同種電荷靜電排斥作用 表面水化作用，形成水化層 無機(jī)鹽促凝聚作用：

6、 加入相反電性電解質(zhì)，中和膠體表面電荷，降低了雙電層的排斥力 無機(jī)鹽在水中的水化作用，破壞了膠粒水化層 影響凝聚作用的主要因素有無機(jī)鹽的種類、化合價(jià)以及無機(jī)鹽的用量等。 通常培養(yǎng)液中細(xì)胞或菌體帶負(fù)電荷，常采用高價(jià)陽離子促其凝固。 陽離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用的凝聚劑有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。 （2）加入絮凝劑）加入絮凝劑 絮凝劑：有機(jī)高分子，易溶，鏈長(zhǎng)，活性功能基團(tuán)多 絮凝作用： 當(dāng)往膠體懸浮液中加入絮凝劑時(shí)，膠粒可強(qiáng)烈吸附在絮凝劑表面的功能團(tuán)上，而且一個(gè)高分

7、子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上，形成架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來，有助于過濾。 影響因素： 分子量：大，效果好；過大，溶解度 用量：低濃度增加用量有助架橋，濃度過高吸附飽和失去架橋作用，降低了效果。 pH：影響功能團(tuán)電離度，電離度，鏈伸展， 效果 操作條件： 攪拌：初期，快好；后期，會(huì)破壞絮凝團(tuán)（3）變性作用）變性作用 天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理因素（如熱、紫外線照射、高壓和表面張力等）、化學(xué)因素（如有機(jī)溶劑、脲、胍、酸、堿等）影響時(shí)，生物活性喪失，溶解度降低，不對(duì)稱性增高以及其他的物理化學(xué)常數(shù)發(fā)生改變。 用途： 雜蛋白質(zhì)變性沉淀析出 方法： 加熱、大幅度改變pH，加有機(jī)

8、溶劑、重金屬鹽或表面活性劑（4）吸附）吸附 方法： 加入吸附劑：活性碳除熱原 加入反應(yīng)劑：相互作用形成沉淀吸附蛋白質(zhì) 四環(huán)素發(fā)酵液：黃血鹽+硫酸鋅，生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3Fe(CN)62的膠狀沉淀，能將雜蛋白質(zhì)和菌體等黏附在其中而除去。 枯草桿菌的堿性蛋白酶發(fā)酵液： 氯化鈣+磷酸鹽生成磷酸鈣鹽沉淀（吸附、助濾），不僅能吸附雜蛋白和菌體等膠狀懸浮物，還能起助濾劑作用（5）等電沉淀 蛋白質(zhì)是一種兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電荷，堿性溶液中帶負(fù)電荷而在某pH 下，凈電荷為零，稱為等電點(diǎn)，此時(shí)它在水中溶解度最小，能沉淀除去。 硫酸軟骨素是自哺乳動(dòng)物氣管等軟骨提取而得的酸性黏多糖。制備過中先將豬喉(鼻

9、)軟骨提取出來鹽解后調(diào)pH 23，攪拌10min，靜置后再濾至澄清，以 除去酸性雜蛋白。 有些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度，單靠等電點(diǎn)的方法還不能 將其大部分沉淀除去。通常可結(jié)合其他方法，如加熱、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等以增強(qiáng)沉淀 效果。 常與其他方法合用（6）加各種沉淀劑沉淀 沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物沉淀（6）加各種沉淀劑沉淀 沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物沉淀在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離 予如互氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、，苦味酸鹽、鞣酸鹽、。過氯酸鹽等形成沉淀。在堿 性溶液中，能與一些陽離子如 Ag+、Cu2+、zn2+、Fe3+和 Pb2+等形成沉淀只如在四環(huán)素 發(fā)酵液中加入的硫酸鋅，可

10、促進(jìn)一些蛋白質(zhì)沉淀。2.多糖的去除 酶：轉(zhuǎn)化為單糖 如發(fā)酵液中殘留的淀粉：淀粉酶 粘多糖與一些陽離子表面活性劑如十六烷基溴化銨（CTAB）形成沉淀 Mg2+三聚磷酸鈉三聚磷酸鈉(Na5P3P10)形成三聚磷酸形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物鈉鎂可溶性絡(luò)合物 Ca2+ 草酸、草酸、草酸鈉草酸鈉形成草酸鈣沉淀形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸） Fe2+ 黃血鹽黃血鹽(K4Fe(CN)6) 普魯士藍(lán)普魯士藍(lán) 沉淀沉淀3.高價(jià)金屬離子的去除 微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，細(xì)胞膜和它所包圍的細(xì)胞漿合稱原生質(zhì)體。 動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。 通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜

11、脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來自于細(xì)胞壁。第二節(jié) 細(xì)胞破碎 一、機(jī)械法1、勻漿法2、珠磨法3、超聲波三、化學(xué)法1.化學(xué)試劑處理2.制成丙酮粉二、物理法1.干燥2.凍融3.滲透壓沖擊四、生物法1.酶解法2.自溶 一、機(jī)械法 原理：剪切力1.高壓勻漿器 原理：進(jìn)入高壓室的細(xì)胞懸浮液被強(qiáng)迫通過一個(gè)狹窄的小孔，產(chǎn)生液相剪切力引起細(xì)胞破碎。 易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌， 較小的革蘭氏陽性菌， 含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。 不宜采用高壓勻漿法的微生物：不宜采用高壓勻漿法的微生物

12、：2.高速珠磨機(jī) 原理：玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌，研磨作用，細(xì)胞破碎。操作過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，易造成某些 生化物質(zhì)破壞，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻璃小珠。3.超聲波振蕩器 原理：利用超聲波的空穴作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。 影響因素：超聲波的聲強(qiáng)、頻率、破碎時(shí)間、介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH、菌體的濃度和種類。 一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。超聲破碎時(shí)細(xì)胞濃度一般在20左右。 超聲波破碎法在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用較廣。操作時(shí)常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷卻到05，并且還應(yīng)在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。二、物理法1.

13、干燥法 原理：干燥后的菌體，期細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用丙 酮、丁醇或緩沖液溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來。 氣流干燥氣流干燥主要適用于酵母菌主要適用于酵母菌，一般在一般在2530的氣流中吹干；的氣流中吹干；真空干燥真空干燥多用于細(xì)菌多用于細(xì)菌；冷凍干燥；冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì)適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì)。 2.反復(fù)凍融法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。原理： 細(xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增加細(xì)胞親水性 冰晶粒使細(xì)胞破裂 適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。 3.滲透壓

14、沖擊法 原理： 細(xì)胞在濃鹽中平衡，再投入水中膨脹破裂。三、化學(xué)法1.加入化學(xué)試劑 采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。 堿：溶解除細(xì)胞壁外大部分組分，改變pH，改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì) 有機(jī)溶劑：如丁醇、丙醇、三氯甲烷等，他們能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而將胞內(nèi)產(chǎn)物抽提出來。但是，這些溶劑容易生物活性物質(zhì) 破環(huán)，使用時(shí)應(yīng)考慮其穩(wěn)定性，操作要在低溫下進(jìn)行，處理后還必須將抽提液中的有機(jī)溶 劑進(jìn)行分離回收。三、化學(xué)法1.加入化學(xué)試劑 表面活性劑：改變膜的通透性，細(xì)胞溶解 胞內(nèi)異淀粉酶：0.1%SDS，30振蕩30h2.丙酮粉 保存+破碎 脫

15、水脫脂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散方法： 組織或勻漿懸浮0.01mol/LpH6.5的磷酸緩沖溶液中，0 一邊攪拌，一邊徐徐倒入10倍體積的-15 丙酮內(nèi)，10min后離心過濾取其沉淀，反復(fù)用冷丙酮洗幾次，真空干燥得。四、生物法1.酶解法： 機(jī)理：利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵常常用用的的溶溶酶酶G+ 溶菌酶溶菌酶G- 溶菌酶、溶菌酶、EDTA放線菌放線菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、植物植物 纖維素酶、半纖維素酶纖維素酶、半纖維素酶細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物 -加入酶：溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等酶解法的優(yōu)點(diǎn) 發(fā)生酶解

16、的條件溫和 能選擇性地釋放產(chǎn)物 胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便于后步分離等 但酶水解價(jià)格高，故小規(guī)模應(yīng)用較廣 2. 自溶：u誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。u微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法和干燥法。 酵母細(xì)胞：4550，12-24h 1.規(guī)模及成本 大規(guī)模：高壓勻漿、珠磨 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：超聲波振蕩 2.目的物的穩(wěn)定性 干燥法、有機(jī)溶劑對(duì)活性影響大 保護(hù)性措施 3.破碎效果和產(chǎn)物釋放率 動(dòng)物細(xì)胞：滲透壓沖擊、凍融法 微生物細(xì)胞：結(jié)合酶法 高釋放率又不能使細(xì)胞碎片太小適宜的操作適宜的操作條件應(yīng)從條件應(yīng)從高高的產(chǎn)物釋放的產(chǎn)物釋放率率、低的能低的能耗耗和和便于