1、涂片與培養及PCR/RLB檢測淋病奈瑟菌的比較研究                作者：何大源，向華國，楊波，黃玉佳  【摘要】  目的：建立以16S rRNA為靶基因的PCR反向線點雜交技術（RLB）檢測淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, NG），并與涂片法及培養法比較。方法：選擇NG 16S rRNA基因設計一對PCR引物，生物素標記下游引物擴增NG DNA，然后與固定在尼龍膜上的特異性寡核苷核探針雜交。并對1

2、15例性病高危人群標本進行檢測，然后與涂片法與培養法檢測結果進行比較。結果：PCR擴增NG DNA的片段長度分別為414 bp。通過對115例臨床標本的檢測， PCR/RLB的陽性率為31.3%,而涂片法和培養法的陽性率分別為15.7%和21.7%。 結論：PCR/RLB是一種快速、敏感的檢測方法，對NG感染的實驗診斷具有十分重要的意義。 【關鍵詞】  聚合酶鏈反應；核酸雜交；淋病奈瑟氏菌The study of Comparing with Smear, Culture and PCRreverse Line Hybridization Assay for Detecting Ne

3、isseria Gonorrhoeae   Abstract：Objective To develop 16S rRNA PCRreverse line blot hybridization (RLB) assay for detection of N. gonorrhoeae and compare it with smear and culture methods. Methods The DNA from N. gonorrhoeae was amplified with the one set of primer for the 16S rRNA gene. The

4、 reverse primers were labeled with biotin. The products were identified by hybridization with its specific oligonucleotide probes labeled with amidogen in a nylon membrane. Then using PCRRLB to detect 115 specimens and compare it with smear and culture methods. Results The length of PCR products was

5、 414 bp. The PCRRLB positive rate (31.3%) is higher than smear (15.7%) and culture (21.7%)(P0.05). Conclusion The results of PCRRLB in detecting N. gonorrhoeae also provided excellent results. It plays the very important role in detecting of clinical pathogens.   Key words：Polymerase chain

6、 reaction; Nucleic acid hybridization; Neisseria gonorrhoeae   淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae ，NG）感染引起的一種常見的性傳播疾病（STD），約占全球STD病例的3/4，在我國亦呈逐步蔓延之勢1。流行病學資料顯示NG感染是加速HIV傳播的危險因素，所以選擇更加特異、敏感的檢測方法對于NG的準確診斷及HIV的防治都具有十分重要的意義2。近年來核酸擴增技術在NG感染檢測方面得到了廣泛的應用,特別是PCR技術，相比于傳統的培養法，核酸擴增技術具有較高的敏感性和易于標本收集轉運。本文利

7、用以16S rRNA基因作為靶基因設計PCR引物,再結合反向線點雜交技術對115份臨床標本進行檢測，并將結果與涂片法和培養法進行比較。1  材料和方法1.1  材料1.1.1  標本來源 115份性病高危人群標本來源于深圳市福永醫院門診患者，每人同時收集3份標本，1份做涂片，1份做培養，1份做PCR/RLB檢測。1.1.2  主要試試劑與儀器 Biobyne C 尼龍膜由Pall公司生產，鏈親和素過氧化物酶接合物由Roch 公司生產，Taq酶、dNTP購自MBI公司。 Eppendorf公司PCR擴增儀和Shellab雜交箱。1.2&

8、#160; 方法1.2.1  涂片 標本涂片自然干燥后，革蘭染色鏡檢，找到多核白細胞內革蘭陰性雙球菌者為陽性。1.2.2  細菌培養 標本同時接種于血瓊脂平板和選擇性淋病奈瑟菌培養基，置5%10%燭缸內，在36.5恒溫箱內培養24 h36 h，觀察結果，根據菌落形態，過氧化物酶陽性，并且涂片鏡檢為革蘭陰性球菌者為陽性。1.2.3  DNA提取 將標本置于含有100 l PCR裂解液（含10 mm PH 8.0 的Tris ,4.5% Triton X100,4.5% Tween 20）的Eppendorf管中，99煮沸30 min后離

9、心備用。1.2.4  PCR 反義引物5端為生物素標記，特異性探針5端用氨基標記（見表1）。PCR反應體系25 l，含10  buffer 2.5 l，42.5 mmol/L dNTP 2 l，25 mol/L MgCl2 1.5 l, 5U/lTaq 酶0.2 l，50 pmol引物各0.2 l，模板5 l，補水至25 l。反應條件：95 5 min后，95 0.5 min、58 0.5 min、72 1 min、35個循環，最后72 5 min。表1  淋病奈瑟氏菌引物和特異性寡核苷核探針序列（略）注：SLA 和SLB為引物， SLP為探針 

10、;        1.2.5  制膜及探針標記   制備BiodyneC尼龍膜參見文獻3。用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀釋opap和SL80p探針，使探針濃度分別為1.25 pmol、0.625 pmol和0.313 pmol。1.2.6  RLB鑒定 參見文獻3簡述之，將PCR擴增產物取5 l加入含170 l 2×SSPE/0.1%SDS溶液的管中，混勻后100煮10 min，將EP管置于冰中迅速冷卻。用60 2×SSPE/0.1%S

11、DS液漂洗已標記探針的膜5 min，然后將膜置于Miniblotter上，在Miniblotter槽中分別依次加入150 l PCR擴增產物和2×SSPE/0.1%SDS混合液。60雜交1 h。用60 2×SSPE/0.5%SDS液洗兩次，10 min/次。加入2×SSPE/0.5%SDS和1/5000鏈親和素過氧化物酶接合物混合液，42孵育1 h，再用42 2×SSPE/0.5%SDS液洗膜兩次，10 min/次。再于室溫入用2×SSPE液洗膜兩次，5 min/次，加ECL覆蓋于膜上，1 min后將膜顯影5 min。2  結果

12、60;  115份性病高危人群的臨床標本經PCR/RLB檢測其陽性率31.3%（36/115），而涂片法與培養法分別為15.7%（18/115）和21.7%（25/115）。其中11份培養法陰性標本經PCR/RLB檢測為陽性，18份涂片法陰性標本經PCR/RLB檢測為陽性。不同的標本類型對三種方法的檢測影響不盡相同，其中前列腺液、宮頸拭子、尿道拭子和白帶標本利用涂片法其陽性檢出率最低，而培養法次之，而生殖道分泌物標本利用三種方法其陽性檢出率差異無顯著性。表2  PCRRLB與涂片法和培養法檢測淋病奈瑟氏菌的比較(略)3  討論   本文選用了編

13、碼NG大亞基核糖體的16S rRNA基因作為檢測靶基因設計引物和探針。通過對115份標本檢測表明PCR/RLB陽性率最高，為31.3%，明顯高于涂片法（15.7%）和培養法（21.7%），其中涂片法最低，只有15.7%，主要是對宮頸拭子、白帶、前列腺液和尿道拭子標本陽性檢出率較低。相比之下， 3種方法檢測生殖道分泌物其陽性檢出例數則無明顯差別。主要原因可能是由于尿道拭子標本和前列腺液中NG含量要少于生殖道分泌物。女性淋菌性尿道炎和宮頸炎不典型，無特異性，診斷依靠病原體鑒定，陰道內有類似淋病奈瑟菌形態的雜菌，涂片難以鑒別，而培養時，敏感性也不高。   由于PCR具有較高的敏感

14、性，在DNA提取、PCR擴增、雜交過程是均需設立陽性和陰性對照，同時對RLB的雜交條件進行了優化。在本試驗中我們以氨基標記各特異性寡核苷酸探針5端，再與尼龍膜上的羧基結合制備成膜芯片，并通過反向線點雜交使固定在尼龍膜上的探針與含有生物素標記反義引物的5端的PCR產物雜交，然后通過化學發光檢測NG。與同位素標記探針結合放射性自顯影技術相比，該技術克服了放射性污染，且具有檢測信號放大作用，具有較高的敏感度。與硝酸纖維膜作為載體相比較，尼龍膜除具有結合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力強，韌性較強，操作較方便外4。更重要的是可對重復用于雜交，一次雜交后，PCR產物可用1%  SDS 80變性而被洗脫下來，從而重復使用，極大地節約了成本和時間。   本文著重對三種檢測NG的方法進行比較，相比之下PCR/RLB陽性率最高。它不僅可用于一般人群NG感染的初篩實驗，而且對于女性及慢性患者有較為理想的診斷價值，值得推廣應用。【參考文獻】  1馮捷. 淋病的治療進展J. 中國全科醫學,2000,3(4):260262. 2向華國, 熊禮寬, 涂植光. 淋病奈瑟氏菌感染的實驗診斷進展J. 重慶醫學,2006,3