1、p53基因引物設(shè)計 臨床八年1305班馮昊 CONTENTS目錄Part 1引物設(shè)計原則Part 2獲取目的基因Part 3引物設(shè)計引物的設(shè)計原則設(shè)計的目的是在兩個目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率PARTONE12引物長度一般引物長度為1830堿基。決定引物熔解溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。長度越長，Tm值越大。長度過長，退火溫度和延長溫度相差太小，不利于延伸反應(yīng)。長度過短，特異性低GC含量一般為40%60%，一對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5端加適量的A、T或G、C尾巴引 物 設(shè) 計 原 則3引物自身和引物之間引物自身不應(yīng)形

2、成二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）引 物 設(shè) 計 原 則引物之間不能形成二聚體（包括同種引物之間或上游引物與下游引物之間）且引物不能與DNA其他區(qū)域錯配引 物 設(shè) 計 原 則4引物末端引物3端：由于延伸從3端開始，因而不能進(jìn)行任何修飾；同時不應(yīng)選擇A，因為A-A、A-G錯配。3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)引物5端：主要限定引物長度，對擴(kuò)增特異性影響不大；可以修飾，如添加限制性內(nèi)切酶位點，將PCR產(chǎn)物亞克隆引 物 設(shè) 計 原 則 引物5端修飾技術(shù)附加核酸序列 用 途 限制酶位點 克隆（如定向克隆）噬菌體啟動子 合成RNA探針、測序蛋白質(zhì)結(jié)合序列 產(chǎn)物純化、檢測核糖體

3、結(jié)合序列 高效表達(dá)加錯配堿基造成突變 定點誘變5避開靶基因的二級結(jié)構(gòu)區(qū)PARTTWO獲取目的基因利用Genbank數(shù)據(jù)庫搜尋DNA、mRNA或者蛋白質(zhì)序列來設(shè)計引物獲 取 目 的 基 因/genbank/mRNA對應(yīng)DNA序列蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)編碼區(qū)外顯子對應(yīng)的DNA序列、基因、編號單擊CDS后PARTTHREE引物設(shè)計利用生物軟件和網(wǎng)頁進(jìn)行引物的設(shè)計和評價引 物 設(shè) 計 Primer premier 5最常用的引物設(shè)計軟件Oligo 7常和PP5聯(lián)用評估引物NCBI Primer-blast近幾年NCBI推出的網(wǎng)站此區(qū)域輸入待測DNA序列上游引物下游引物引 物 設(shè) 計 結(jié) 果 （一例） 引物與DNA結(jié)合情況RT-PCR由于后面要應(yīng)用于RT-PCR，復(fù)制的是cDNA，而cDNA中沒有內(nèi)含子，所以在設(shè)計引物時應(yīng)該用編碼區(qū)結(jié)果：簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。簡 并 引 物M -A C S -G C W -A T R -G A Y -T C K - G