1、細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料地制備及其抗菌性能研究摘 要：細(xì)菌纖維素bacterial cellulose, bc ）是一種由微生 物合成地高純度纖維素，超細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使其具有高比表面積、 高持水能力以及良好地生物相容性和生物可降解性，被認(rèn)為是一種潛在地“理想”醫(yī)用敷料材料.然而，細(xì)菌纖維素本身不具有抗菌 性能，難以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染地傷口 .納M銀是一種廣譜抗菌劑.因此本 文以細(xì)菌纖維素為模板，采用環(huán)境友好地化學(xué)還原劑抗壞血酸為還 原劑，原位制備細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料.同時(shí)分別采用抑菌圈 法和最小抑菌濃度法對(duì)復(fù)合物地抗菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià) .關(guān)鍵詞：細(xì)菌纖維素 納M銀抗菌創(chuàng)傷敷料一、引言細(xì)菌纖維素是

2、一種由微生物合成地高純度纖維素，其微纖維直徑 只有40-60nm,是自然界中天然存在地精細(xì)納 M材料.超細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu)使其具有高比表面積、高持水能力以及良好地生物相容性和 生物可降解性，被稱作“大自然賦予人類地天然生物醫(yī)用材料” 1.大量研究和臨床實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌纖維素基創(chuàng)傷敷料對(duì)于燒傷燙 傷以及慢性潰瘍疾病具有良好地治愈效果，是一種極具潛力地“理 想”創(chuàng)傷敷料材料2.然而，細(xì)菌纖維素本身不具有抗菌性能，難以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染地傷 口 .金屬銀及其化合物是目前最常用地?zé)o機(jī)抗菌劑，尤其適用于治 療燒傷燙傷以及慢性潰瘍創(chuàng)傷3.因此，以細(xì)菌纖維素為載體負(fù)載 納M銀粒子將有望獲得具有高效保濕抗菌功能地“理想

3、”醫(yī)用創(chuàng)傷敷料.孫東平等以細(xì)菌纖維素為載體，甲醛為還原劑采用液相化 學(xué)還原法合成載銀細(xì)菌纖維素復(fù)合材料，所得銀納M粒子平均粒徑 在45nm左右，對(duì)大腸桿菌、酵母菌和白色念珠菌等都有理想地抗 菌效果4.marques等分別以細(xì)菌纖維素和普通植物纖維為基體， 采用nabh4原位還原agno3地方法在纖維素膜上合成納 M銀單質(zhì)， 結(jié)果表明細(xì)菌纖維素纖維地銀負(fù)載量可達(dá)到植物纖維地50倍以上,并且對(duì)ag+具有更持久地控釋作用，是一種良好地納M銀合成基質(zhì) 5,上述研究大多采用nabh4、甲醛等化學(xué)t劑為還原劑，這些試 劑通常具有較高地人體毒性，反應(yīng)結(jié)束后很難解決試劑在纖維膜內(nèi) 地殘留問題，尤其不適合應(yīng)用于

4、生物醫(yī)用材料產(chǎn)品地制備.據(jù)此，我 們提出，以細(xì)菌纖維素為模板，摒棄有毒化學(xué)還原試劑，采用環(huán)境友 好地抗壞血酸為還原劑，原位制備細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料.二、材料與方法一）實(shí)驗(yàn)材料木醋桿菌acetobacter xylinum ）:本實(shí)驗(yàn)室保藏.agno3、抗 壞血酸購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其它試劑若無特殊說明， 均為市場(chǎng)可售.二）細(xì)菌纖維素膜地制備和純化以木醋桿菌為菌種，將活化后地菌種接種至種子培養(yǎng)液中，在 30c和160rpm地?fù)u床中培養(yǎng)24h,按6燉接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng) 基中,30 C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8 d,得細(xì)菌纖維素膜,培養(yǎng)基組 成為麥芽糖25g/l,蛋白月東3g/l,酵

5、母浸膏5g/l,ph值為5.0,121 C滅菌20 min.將bc膜取出用去離子水反復(fù)沖洗，再浸泡于0.1%地naoh溶液中 以去除細(xì)菌纖維素膜中地菌體及殘留培養(yǎng)基，80 C處理6h至膜呈 乳白色半透明.最后用去離子水充分洗滌，直至洗液成中性.三）細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料地制備將上述bc膜浸泡于一定濃度地硝酸銀溶液中，在30 c恒溫水浴 鍋中100rpm震蕩12h.然后將膜取出放入10mmfe抗壞血酸溶液中， 在磁力攪拌下冰浴還原6h.然后取出用去離子充分洗滌，得細(xì)菌纖 維素/納M銀復(fù)合材料.四）含銀量地測(cè)定將制備地復(fù)合物樣品干燥后剪碎，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量溶解于hno3 溶液中.采用原子吸收法

6、測(cè)定其銀含量.五）抗菌性能地測(cè)定1）抑菌圈法以金黃色葡萄球菌為模型菌.具體方法為：將金黃色葡萄球菌從 斜面接種到種子培養(yǎng)基中,37 C恒溫培養(yǎng)12h得種子液.吸取0.1ml 種子液至固體平板培養(yǎng)基上，涂布均勻.將載銀細(xì)菌纖維素膜平鋪 在平板中央，37 C恒溫倒置培養(yǎng)24h.然后測(cè)量其抑菌圈大小，并以 不載銀地純細(xì)菌纖維素膜為對(duì)照組.抑菌帶寬度定義為：抑菌帶半 徑平均值與樣品膜半徑平均值之差.2）最小抑菌濃度法mic）以金黃色葡萄球菌為模型菌，采用mic法定量評(píng)價(jià)復(fù)合物地抗菌效果.具體方法為：將10個(gè)滅菌地含一定量培養(yǎng)基地三角瓶分別 編號(hào)1-9號(hào)，在培養(yǎng)基中放入1-9片載銀細(xì)菌纖維素膜制成不同含

7、 銀量培養(yǎng)基.然后，取107cfu/ml地金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml 接種于上述1-9號(hào)三角瓶中，于37c恒溫培養(yǎng)24h.培養(yǎng)結(jié)束后，分別從上述三角瓶中取出0.1ml培養(yǎng)液,將其涂布 到瓊脂平板上，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，于37c恒溫培養(yǎng)箱中倒置培 養(yǎng)24h,觀察菌落地生長(zhǎng)情況.以不長(zhǎng)菌地最低濃度為最小抑制濃度 mic).三、結(jié)果與討論一)細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料地制備目前化學(xué)法還原制備納 M銀粒子大多采用nabh4、甲醛等化學(xué)試 劑為還原劑，這些試劑通常具有較高地人體毒性，反應(yīng)結(jié)束后需解 決試劑在纖維膜內(nèi)地殘留問題，不適合應(yīng)用于生物醫(yī)用材料產(chǎn)品地 制備.抗壞血酸是一種常用地醫(yī)藥原料，具有一

8、定地還原能力.因此 本文嘗試以抗壞血酸為還原劑，細(xì)菌纖維素為模板，原位還原制備 納M銀.實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間地延長(zhǎng)，細(xì)菌纖維素膜由初 始地透明色逐漸變?yōu)榱咙S色，表明納M銀粒子在細(xì)菌纖維素膜上形 成 圖1).二)含銀量地測(cè)定分別選用1.0、2.5及5.0mm地硝酸銀溶液制備細(xì)菌纖維素/納M 銀復(fù)合材料，采用原子吸收法測(cè)定不同硝酸銀溶液濃度條件下復(fù)合 物地載銀量情況，結(jié)果如圖2所示.結(jié)果顯示，隨著硝酸銀濃度地升高，復(fù)合膜地含銀量增加.但當(dāng)硝酸銀濃度大于2.5mm日t繼續(xù)增加 硝酸銀濃度，復(fù)合物地載銀量幾乎不變，這說明此時(shí)可能達(dá)到了細(xì) 菌纖維素膜地最大銀負(fù)載量.三)抗菌活力地評(píng)價(jià)首先采用抑菌

9、圈法對(duì)細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料地抗菌活力進(jìn) 行定性評(píng)價(jià).分別考察了上述三種硝酸銀溶液所制備地復(fù)合物地抗 菌效果 圖3).如圖所示，復(fù)合物產(chǎn)生地抑菌圈地變化趨勢(shì)與其載 銀量相似，這說明復(fù)合物載銀量地高低與抑菌圈寬度有一定相關(guān)性 即載銀量越高，抑菌圈越大.采用最小抑菌濃度法定量評(píng)價(jià)細(xì)菌纖維素/納M銀復(fù)合材料地抗 菌活力，如圖4所示.由結(jié)果可知，當(dāng)硝酸銀濃度為1.0mm時(shí),mic值 最低，說明該制備條件下，復(fù)合膜地抗菌效果最好.在較高地硝酸銀 濃度條件下，由于較高量地銀粒子負(fù)載到細(xì)菌纖維素膜上，可能會(huì) 產(chǎn)生銀粒子團(tuán)聚，進(jìn)而影響其抗菌效果.四、結(jié)論本文以細(xì)菌纖維素為模板，抗壞血酸為還原劑，原位制備細(xì)

10、菌纖 維素/納M銀復(fù)合材料，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行研究.結(jié)果表明，在較 低地硝酸銀濃度條件下，所得復(fù)合膜地載銀量較低，抑菌圈較小，但 其最小抑菌濃度值較低.這可能是由于較低地銀負(fù)載量減弱了銀粒 子地團(tuán)聚現(xiàn)象，導(dǎo)致其抗菌效果較好.基金工程：國家自然基金工程no.21004008);上海市教育委員會(huì)和上海市教育發(fā)展基金會(huì)“晨光計(jì)劃”工程 no.11cg35).參考文獻(xiàn)1czaja w,krystynowicz a,bielecki s,brown rm.microbial cellulosethe natural power to healwounds.biomaterials,2006,27:145

11、-151.2alvarez o m,patel m,booker j,markowitzl.effectiveness of a biocellulose wound dressing for the treatment of chronic venous leg ulcers:results of a single center randomized study involving 24 patients.wounds,2004,16:224-233.3rai m,yadav a,gade a.silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials.biotechnol.adv.,2009,27:76- 83.4孫東平，楊加志,李駿，周伶俐，于俊偉.載銀細(xì)菌纖維素抗菌 敷料地制備及其抗菌性能地研究.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2009,26 : 1034-1038.5pinto r j