1、心肌缺血再灌注時Gs和Gi蛋白含量mRNA水平變化及意義(一)    作者：鐘前進，汪曾煒，肖穎彬【關鍵詞】 心肌缺血Changes and significance of levels of Gs and Gi and their mRNA in myocardium undergoing ischemic reperfusion【Abstract】 AIM: To study the changes of the levels of subunits of stimulatory (Gs) and inhibitory (Gi) guanine nu

2、cleotidebinding protein and their mRNA in newborn guineapig myocardium undergoing global ischemic reperfusion and to explore the relation between these changes and cardiac functions. METHODS: Thirty newborn guineapigs were randomly assigned to three groups (n=10 in each group) and isolated perfused

3、working heart models were established. The newborn hearts suffered global ischemia alone for 90 min in group, arrested by St. Thomas Hospital cardioplegic solution simultaneously in group and arrested by cold blood cardioplegia simultaneously in group . All the hearts were reperfused for 60 min. Car

4、diac functions and the levels of Gs and Gi and their mRNA were investigated. RESULTS: The cardiac functions were markedly deteriorated in group and group during reperfusion (P0.01), whereas no pronounced changes of cardiac functions were found at the end of reperfusion in group (P>0.05). Signific

5、ant decreases of the levels of Gs and its mRNA (P0.01) and notable increases of levels of Gi and its mRNA (P0.01) were found in group and group after ischemia and after reperfusion when compared with those before ischemia and in group , but recovery to the levels of Gs and Gi and their mRNA before i

6、schemia was achieved in group after reperfusion (P>0.05 vs before ischemia). CONCLUSION: Ischemic reperfusion injury of immature guinea pig myocardium may result from the unbalance between Gs and Gi.【Keywords】 myocardial ischemia; myocardial reperfusion injury; GTPbinding proteins; cardioplegic s

7、olutions; guineapigs【摘要】 目的：研究新生豚鼠心肌缺血再灌注時Gs和Gi蛋白含量及其mRNA水平的變化以及與心功能變化的關系. 方法： 30只新生豚鼠隨機分為3組（每組n=10），建立離體心臟左心做功模型. 組： 離體心臟缺血90 min；組：缺血時予Thomas 號液；組：缺血時予冷血心停搏液. 各組均再灌注60 min. 檢測心功能指標，Gs和Gi蛋白含量及其mRNA水平的變化. 結果： 組和組在再灌注時的心功能明顯受損（P0.01），組在再灌注結束時無明顯變化（P>0.05）. 組和組在缺血后和再灌注后Gs蛋白含量分別為缺血前的37.5%, 40.3%, 36

8、.6%和39.5%，Gs mRNA水平分別為缺血前的38.6%, 41.4%, 35.7%和40.1%，明顯降低(P0.01)；Gi蛋白含量分別為缺血前的198.1%, 175.4%, 201.3%, 181.4%，Gi2 mRNA水平分別為缺血前的215.4%, 180.2%, 210.3%和176.2%，顯著升高(P0.01). 組在再灌注后Gs和Gi蛋白含量及其mRNA恢復至缺血前的水平（P>0.05）. 結論： Gs和Gi蛋白的平衡遭受破壞可能是未成熟心肌缺血再灌注損傷發生的機制之一. 【關鍵詞】 心肌缺血；心肌再灌注損傷；GTP結合蛋白質類；心麻痹液；豚鼠0引言鳥嘌呤核苷酸偶聯

9、蛋白(G蛋白)在細胞信號轉導過程中起著“電話交換機(switchboard)樣”作用1，與心臟病理生理過程密切相關2. 對心肌缺血再灌注過程中G蛋白變化的研究有益于增強對心肌缺血再灌注損傷的認識，是一值得探討的課題. 有關未成熟心肌缺血再灌注時興奮性鳥核苷藕聯蛋白亞基(Gs)和抑制性蛋白亞基(Gi)蛋白含量的變化及其mRNA水平的變化鮮見研究報道3，我們擬以新生豚鼠為研究對象，利用離體工作心臟模型，運用Western印跡分析和Northern印跡分析等方法對此進行研究. 1材料和方法1.1材料 實驗分組和模型：02 d齡新生豚鼠，雌雄不拘，體質量5080 g. 實驗隨機分為3組（每組n=10）

10、. 建立離體心臟順灌左心做功模型4： 取豚鼠心臟,將主動脈斷端套于主動脈插管上，行Langendorff逆灌，灌注液為KH液，心臟復跳. 行左房插管,停止逆灌，經左房順行灌注. 停止順灌，組（低溫組）于20全心缺血90 min，組(Thomas組)和組（冷血組）在缺血開始、第30 min和第60 min時經主動脈分別逆灌10 Thomas 號液和冷血心停搏液. 之后，三組均給予37氧合KH液逆灌，使心臟復跳，爾后再灌60 min. 抗體和cDNA探針 RM/1Gs蛋白多克隆抗體和AS/7 Gi蛋白多克隆抗體（美國NEN公司）；大鼠Gs和Gi2 cDNA探針（美國NEN公司），長度分別為1737

11、 bp和1748 bp. 1.2方法 1.2.1心功能指標測定在缺血前和再灌注15， 30， 45和60 min時，將左心室測壓管連接于MPAIV型多導生物信號分析系統（第二軍醫大學生理學教研室研制），測定各組左室收縮峰壓（LVPSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內壓正負相最大變化速率（±dp/dtmax）、心輸出量（CO）. 1.2.2Western 印跡分析將冷凍心肌組織置于4預冷的含1 mol/L MgCl2， 25 mol/L三（羥甲基）氨甲烷/鹽酸（Tris/HCl），0.4 mol/L甲苯磺酰氟（PMASF， Sigma公司）和1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）的心

12、肌勻漿液中，勻漿制備膜蛋白，-70貯存備用. 120 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），每一樣品上樣75 g，以電轉移的方式轉移至硝酸纖維素膜上. 將膜封閉后，與抗Gs（按滴度11000）和抗Gi（按滴度11000）反應1 h，洗去抗體后將膜置于1500的堿性磷酸酶標記的IgG中反應1 h，Tris緩沖鹽溶液（TBS）充分洗滌，以NBT（氮藍四唑）+BCIP（5溴4氯3吲哚磷酸）顯色，最后攝片記錄. 1.2.3Northern印跡分析以Trizol液提取心肌總RNA，用紫外分光光度法測定并計算其濃度和純度（A260 nm/A280 nm>1.80），將RNA樣品上

13、樣至10 g/L變性瓊脂糖膠上電泳，毛吸法轉移至硝酸纖維素膜上，80真空烘干. 硝酸纖維素膜50雜交過夜后，在預雜交液中加入50 mg/L鮭魚精DNA和32P標記的cDNA探針（2×108cpm/g），50雜交過夜. -70放射自顯影，最后對X膠片進行掃描分析. actin cDNA作為內參照. 1.2.4mRNA和蛋白質含量的確定Western 印跡分析的結果用測得的目標帶的吸光度×面積表示，爾后按占缺血前的百分比進行統計. Northern 印跡分析則將所測值用內參照actin校正后再按占缺血前的百分比進行統計分析. 統計學處理： 各組以缺血前值為100%，并計算缺血后

14、和再灌注后實測值分別與缺血前值的百分率. 數值以x±s表示，用重復測量方差分析進行統計處理，P0.05為有統計學意義. 2結果2.1心臟功能的變化再灌注時，組和組的LVPSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax和CO在各時相點均顯著降低，而 LVEDP顯著升高（P0.01）；組在再灌注60 min時各心功能指標均恢復至與缺血前相當的水平（P>0.05）；組和組的LVPSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax和CO在各時相點均顯著低于，而 LVEDP顯著高于組（P0.01, Tab 1). 表1新生豚鼠心臟功能缺血前和再灌注時的變化（略）2.2心肌Gs蛋白和Gi蛋

15、白含量的變化三組缺血前的Gs和Gi蛋白水平無明顯差異（P>0.05）. 缺血后，組和組Gs蛋白水平顯著低于缺血前(P0.01)，Gi蛋白水平顯著高于缺血前和組（P0.01），兩組之間尚無明顯差異（P>0.05）；再灌注后，組的Gs和Gi蛋白水平與缺血前無明顯差異（P>0.05），且分別明顯高于和低于組和組（P0.01, Tab 2）. Gs蛋白呈現出Mr 45×103和52×103兩條蛋白帶，Gi蛋白呈現出一Mr 41×103蛋白帶(Fig 1). 表2新生豚鼠心肌Gs蛋白和Gi蛋白的變化（略）2.3心肌Gs mRNA和Gi2 mRNA水平的變化

16、三組缺血前的Gs mRNA和Gi2 mRNA水平無明顯差異(P>0.05). 缺血后，組和組的Gs mRNA和Gi2 mRNA水平明顯低于和高于缺血前和組（P0.01）. 再灌注后，組Gs mRNA和Gi2 mRNA水平與缺血前無明顯差異(P>0.05)，且分別明顯高于和低于組和組（P0.01, Fig 2, Tab 3).表3新生豚鼠心肌Gs mRNA和Gi2 mRNA的變化（略）3討論心肌缺血再灌注損傷及其保護一直受到重視5，6. G蛋白作為細胞信號轉導過程中的“電話交換機（switchboard）”4，在許多心肌病理過程中發揮作用5. 未成熟心肌缺血再灌注時G蛋白的變化鮮見研

17、究報道6. 本組研究結果顯示，組心肌缺血后的Gs蛋白水平明顯降低，再灌注后Gs蛋白量雖有所恢復，仍明顯低于缺血前. GsmRNA的表達與Gs蛋白含量的變化平行. 缺血后Gi2 mRNA水平升高，再灌注后雖有所下降，仍明顯高于缺血前，并由此引起Gi蛋白量在缺血后和再灌注后的升高. 由此推測，Gs和Gi的平衡遭受破壞是未成熟心肌缺血再灌注損傷發生的機制之一. Thomas 號液對未成熟心肌缺血再灌注損傷的作用尚有爭議7，冷血心停搏液對成熟和未成熟心肌均具良好保護作用8. 本結果提示，組缺血再灌注后的Gs mRNA水平和Gs蛋白含量明顯降低，而Gi2 mRNA水平和Gi蛋白含量顯著增加. 組缺血后G

18、s mRNA和Gs以及Gi2 mRNA和Gi蛋白水平雖有變化，但在再灌注后恢復至與缺血前相當的水平. 可見，Thomas 液對未成熟心肌缺血再灌注無有效保護可能是由于該液失于對未成熟豚鼠心肌細胞G蛋白的保護，冷血心停搏液對未成熟豚鼠心肌的保護作用與其對G蛋白的保護有著密切的關系. 這從另一個角度說明了Thomas 液和冷血心停搏液的不同心肌保護作用的可能機制. 【參考文獻】1Neer EJ. Heterotrimeric G protein: Organizers of transmembrane signals J. Cell, 1995；80(2): 249-257. 2 Booz GW,

19、 Day JN, Baker KM. Interplay between the cardiac renin angiotensin system and JAKSTAT signaling: Role in cardiachypertrophy, ischemia/reperfusion dysfunction, and heart failure J.J Mol Cell Cardiol, 2002；34(11): 1443-1453.3Boraso A, Ceconi C, Cargnoni A, et al. Betaadrenergic receptors and intracell

20、ular signalling pathway in stunned and nonischemic regionsof pig myocardium J. Basic Res Cadiol, 2001(4)；96: 388-394.4 鐘前進,劉欲團,曹新來,等. 新生豚鼠離體心臟順灌左心做功模型的建立J. 中國病理生理雜志,1999；15(2): 191-192.Zhong QJ, Liu YT, Cao XL, et al. Establishment of model of isolated perfused leftside working heart from newborn guineapig J. Chin J Pathophysiol, 1999；15(2): 191-192. 5馬蘭香,賈國良,張清,等. 高、低劑量極化液對缺血/再灌注心肌保護作用的對比研究J. 第四軍醫大學學報,2003;24(22): 2087-2