1、    體內(nèi)藥物定量分析方法的評(píng)價(jià)與認(rèn)證        體內(nèi)藥物分析涉及的生物樣品種類(lèi)很多，有血清、血漿、尿液、糞便、淋巴液、唾液、膽汁、腦脊液、各種組織等。目前，常用的各類(lèi)藥物有千余種，不同藥物的使用劑量及體內(nèi)處置過(guò)程等方面都有一定的差異，這就導(dǎo)致了不同藥物即使在同一個(gè)體的同一組織中濃度的不同，如血藥濃度從mg水平到pg水平都有；即使在同一個(gè)體內(nèi)，同一種藥物也會(huì)因分布不均一而使各種組織中的藥物濃度不同，相差幾倍到數(shù)百倍。為了進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)及生物利用度方面的試驗(yàn)研究，首先

2、要建立一個(gè)合格的體內(nèi)藥物分析定量方法。建立方法，應(yīng)盡量了解和掌握藥物理化性質(zhì)及體內(nèi)處置過(guò)程，主要應(yīng)考慮分析測(cè)定方法靈敏度與樣品中藥物濃度水平相適應(yīng)，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，選擇測(cè)定方法。常見(jiàn)的體內(nèi)藥物定量分析方法及其特性見(jiàn)表11。測(cè)定方法在用于實(shí)際工作之前，須經(jīng)過(guò)下列內(nèi)容的評(píng)價(jià)(evaluation)和認(rèn)證(validation)。表 1常用體內(nèi)藥物分析方法及其特性方法最低檢測(cè)限(ng)選擇性UV100-FLU1+TLC-UV10+TLC-FLU1+GC-FID1+GC-NPD0.1+GC-ECD0.01+GC-MS0.001+HPLC-UV1+HPLC-FLU0.1+HPL

3、C-ECD0.01+RIA0.001+EIMT0.001+FPIA0.001+1選擇性(selectivity)選擇性表示在其它干擾組分共存的復(fù)雜樣品中，準(zhǔn)確和專(zhuān)一地測(cè)定待分析物的能力。生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多肽、激素、遞質(zhì)、類(lèi)脂、色素、無(wú)機(jī)鹽等)和外源性物質(zhì)(合用藥物、藥物代謝產(chǎn)物、從食物中攝取的物質(zhì)等)，都有可能干擾待測(cè)藥物的定量。此外，生物樣品在提取、濃縮、衍生化等過(guò)程中，所用試劑純度不高，亦會(huì)影響分析方法的選擇性。體內(nèi)藥物分析方法是否有內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，可通過(guò)分析空白樣品來(lái)確定。在臨床前試驗(yàn)中，由于動(dòng)物的種屬、飼養(yǎng)條件控制嚴(yán)格，一般取3個(gè)以上個(gè)體的空白樣品即可；但在臨床試驗(yàn)中，

4、至少需要6個(gè)以上個(gè)體的空白樣品，每個(gè)個(gè)體在用藥前均采空白樣品最好2。體內(nèi)藥物定量分析時(shí)，要特別注意合用藥物及藥物代謝產(chǎn)物的干擾。在空白樣品中加入可能合并應(yīng)用的藥物，其濃度應(yīng)盡可能達(dá)到臨床樣品的高限，以證實(shí)是否對(duì)待測(cè)藥物有干擾。藥物的代謝產(chǎn)物通常極性變大，一般不難與原藥分離，通過(guò)在不同條件測(cè)定用藥前后的生物樣品，可了解有無(wú)代謝物及其是否干擾原藥的定量；最好能同時(shí)測(cè)定代謝物，尤其是活性代謝物。當(dāng)藥物在體內(nèi)發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變時(shí)，對(duì)測(cè)定方法的分離度要求更高；我們?cè)跍y(cè)定兔血清中依托泊苷的過(guò)程中，檢測(cè)到其兩種代謝產(chǎn)物-順依托泊苷和反式依托泊苷羥基酸，依托泊苷與順依托泊苷兩者色譜行為十分接近3。體內(nèi)藥物定量分析方

5、法通常都有微小的干擾存在，尤其是測(cè)定濃度較低時(shí)更應(yīng)引起重視。一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距在最低定量限(limit of quantification,LOQ)之響應(yīng)值的20%以下。另外，最好能采用氣-質(zhì)聯(lián)用儀、液-質(zhì)聯(lián)用儀、二極管陣列檢測(cè)器確認(rèn)實(shí)際樣品的目標(biāo)峰及其純度2。 2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(standard curve and linear range)線性范圍表示儀器能產(chǎn)生成比例響應(yīng)的待測(cè)藥物的濃度范圍。通常是通過(guò)對(duì)加有不同濃度待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品(摸擬生物樣品)逐個(gè)分析來(lái)確定的，一般需要610個(gè)點(diǎn)，高濃度應(yīng)是低濃度的50500倍；如果試驗(yàn)(如毒理藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn))要求濃度范圍很大，可建立

6、兩條頭尾相互重疊的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)線性回歸方程的計(jì)算一般不推薦使用空白樣品，也不應(yīng)強(qiáng)制使標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)坐標(biāo)0點(diǎn)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍較寬時(shí)，應(yīng)考慮采用權(quán)重系數(shù)(1/C或1/C2)以避免偏差。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程一般用最小二乘法直線回歸求得，要求相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。此外，還可采用計(jì)算偏差(Bias%)方法評(píng)價(jià)之，即將標(biāo)準(zhǔn)曲線中每個(gè)濃度(加入值)的響應(yīng)值代入方程中，求得其濃度(計(jì)算值)，偏差(%)=|加入值-計(jì)算值|/加入值×100%，以偏差值恒定和最小為好。如果每個(gè)濃度的偏差均<20%，標(biāo)準(zhǔn)曲線可被接受；如有2個(gè)以上濃度的偏差>20%，其余點(diǎn)不足5個(gè)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重做2.4。在實(shí)際測(cè)定

7、過(guò)程中，不應(yīng)外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。如樣品濃度超過(guò)了最高工作濃度，可適當(dāng)稀釋樣品；如樣品不夠第2次測(cè)定，而該樣品又十分重要時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的高限可外推20%，但結(jié)果應(yīng)以文字注明2。3靈敏度(sensitivity)分析方法的靈敏度包括兩個(gè)方面，檢測(cè)限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。LOD是指分析方法定性檢測(cè)生物樣品中待測(cè)物的最低濃度。LOQ是指分析方法能準(zhǔn)確精密定量測(cè)定生物樣品中待測(cè)物的最低濃度。測(cè)定LOQ和LOD的方法通常是在空白樣品中加入微量標(biāo)準(zhǔn)品，以能產(chǎn)生信/噪比(S/N)3的樣品濃度為L(zhǎng)OD，能產(chǎn)生S/N10的

8、樣品濃度為L(zhǎng)OQ。另外還可測(cè)定一組空白樣品的本底響應(yīng)，由下列公式計(jì)算出：LOD=0+3SD，LOQ=0+10SD，式中0和SD分別是本底響應(yīng)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差5。在實(shí)際研究中，LOQ通常是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，在LOQ以下的樣品濃度可計(jì)為BQL(below the quantification limit)，不能用于藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算，也不能視為0處理2。4回收率回收率是用來(lái)衡量測(cè)定方法對(duì)生物樣品中待測(cè)物的檢測(cè)效能的，表示測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的接近程度，亦即測(cè)量值的正確性。由于生物樣品中干擾組分復(fù)雜多變，來(lái)自不同個(gè)體的樣品可能增加或減少待測(cè)物的分析響應(yīng)，所以測(cè)定前往往需要預(yù)處理、提取、凈化、濃縮等，這

9、樣勢(shì)必造成待測(cè)物的損失。如果模擬生物樣品經(jīng)整個(gè)樣品處理過(guò)程，而相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接分析，兩者的響應(yīng)值之比稱(chēng)為絕對(duì)回收率(absolute recovery)；若標(biāo)準(zhǔn)溶液也經(jīng)過(guò)整個(gè)樣品處理過(guò)程，所得響應(yīng)值之比稱(chēng)為相對(duì)回收率(relative recovery)。絕對(duì)回收率一般應(yīng)大于70%，過(guò)低說(shuō)明方法中待測(cè)物質(zhì)損失嚴(yán)重，過(guò)高(>105%)說(shuō)明有非專(zhuān)一性物質(zhì)干擾；相對(duì)回收率能直接反映測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的接近程度，應(yīng)控制在100%左右(95%105%)。絕對(duì)回收率和相對(duì)回收率都應(yīng)基本恒定，且在高、低濃度時(shí)無(wú)明顯差別。測(cè)定回收率所用模擬生物樣品的濃度至少包含標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的高、中、低三個(gè)點(diǎn)2.5。回收

10、率并非總能反應(yīng)生物樣品的真實(shí)情況，但由于真實(shí)值難以測(cè)得等原因，目前仍常用該指標(biāo)評(píng)價(jià)分析的準(zhǔn)確的。5精密度(precision)精密度表示平行測(cè)定結(jié)果的互相接近程度，一般用變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示，CV亦即重復(fù)測(cè)定同一實(shí)際樣品或模擬生物樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。每次測(cè)定均應(yīng)經(jīng)過(guò)從樣品制備到樣品處理測(cè)定的整個(gè)過(guò)程。CV可分為日內(nèi)(within day)CV和日間(day-to-day)CV，批內(nèi)(intraassay)CV和批間(interassay)CV。隨著儀器性能的改善和自動(dòng)進(jìn)樣器的使用，樣品測(cè)定不再以日來(lái)區(qū)分，而且是成批測(cè)定，這樣情況下使用

11、批內(nèi)、批間CV更具有實(shí)際意義6。求算測(cè)定方法的CV，應(yīng)在曲線標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)取高、中、低三個(gè)濃度，每個(gè)濃度測(cè)定5個(gè)以上樣品。一般要求CV應(yīng)小于15%，低濃度水平或復(fù)雜方法可放寬到小于20%。值得說(shuō)明的是，精密度僅表示測(cè)定的重現(xiàn)性，但精密是保證準(zhǔn)確的提前。6穩(wěn)定性(stability)在樣品方面，應(yīng)考察生物樣品中待測(cè)物在室溫條件下的穩(wěn)定性，冷凍條件下的穩(wěn)定性，反復(fù)冷凍、解凍后的變化，加入穩(wěn)定劑對(duì)待測(cè)物穩(wěn)定性的影響，以解決待測(cè)樣品應(yīng)在什么條件下貯存，貯存不能超過(guò)多長(zhǎng)時(shí)間；同時(shí)，不能忽視對(duì)處理后待分析樣品的穩(wěn)定性考察，分析測(cè)定時(shí)的條件、環(huán)境以及樣品放置時(shí)間都有可能影響結(jié)果。在儀器和試劑方面，儀器的性能不穩(wěn)

12、定、老化、更換配件；試劑長(zhǎng)時(shí)間放置、重新配制、更換來(lái)源或批號(hào)，都會(huì)給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)影響。在人員或環(huán)境方面，操作人員的熟練程度，中途異人，試驗(yàn)跨季節(jié)等，亦會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏差。7質(zhì)量控制(quality control,QC)為了及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確、精密，需要進(jìn)行質(zhì)量控制，以檢測(cè)分析過(guò)程可能出現(xiàn)偶然或系統(tǒng)誤差。其方法一般是設(shè)置高、中、低三個(gè)已知濃度的模擬樣品，每次測(cè)定6個(gè)樣品，要求至少有4個(gè)樣品測(cè)定值在真實(shí)值的±20%范圍內(nèi)，且同一濃度的兩個(gè)樣品不得均超過(guò)真實(shí)值的±20%4。質(zhì)控樣品不能以標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品代替，必需分別制備。USP要求質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品應(yīng)占所有測(cè)定樣

13、品的1/5，并且應(yīng)隨機(jī)加入7。如試驗(yàn)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上單位參加，還應(yīng)進(jìn)行室間質(zhì)量控制(external quality control,EQC)，以保證由不同實(shí)驗(yàn)室(測(cè)定方法有時(shí)不同)得到的結(jié)果準(zhǔn)確、一致。體內(nèi)藥物定量分析方法的評(píng)價(jià)與認(rèn)證是藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度試驗(yàn)研究的重要部分，直接關(guān)系到結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須引起足夠的重視。作者單位：白求恩國(guó)際和平醫(yī)院石家莊050082參考文獻(xiàn)1陳剛主編.治療藥物監(jiān)測(cè).北京：人民軍醫(yī)出版社，1988：792Braggio S,Barnabg RJ,Grossi P,et al.A strategy for validation of bioanalytical methods.J Pharm Biom Anal,1996,14:3753劉會(huì)臣，胡玉欽，王建等.家兔靜脈注射依托泊甙的藥物動(dòng)力學(xué)研究.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，28：5434Shan VP,Mioha KK,Dighe S,et al.Analytical methods validation:bioa