1、可降解的熱敏凝膠化的嵌段聚合物的合成、表征及其作為可注射的藥物輸送載體的研究俞麟、常廣濤、崔亭、張歡、張正、丁建東*聚合物分子工程教育部重點實驗室，復旦大學高分子科學系，上海200433摘要：本文旨在探討可注射的熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物對PEG化藥物的包裹和緩釋，期望把載體材料的緩釋效果和PEG化藥物的長循環效果有效的結合起來。熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物是一種具有良好的生物相容性的可降解的可注射的水凝膠材料。本文一方面研究了端基化修飾對于此類材料熱敏凝膠化性能的影響，另一方面利用該類材料實施了PEG化藥物的包裹和緩釋，第一次把此類載體材料的緩釋

2、效果和PEG化藥物的長循環效果結合了起來。我們合成了一系列新型的熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物，研究了其體內外降解、材料的生物相容性和可注射性，合成了PEG化的喜樹堿（MPEG-CPT）作為模型的PEG化藥物，考察了PEG化喜樹堿在該類水凝膠載體中的體外緩釋行為和體內的抗腫瘤的效果。結果表明，功能端基、嵌段長度以及親疏水比例能夠顯著影響該類聚合物材料的熱敏凝膠化性能，從而直接影響到能否作為一種物理凝膠包裹藥物和是否具有可注射性；結果還表明，載體具有良好的生物相容性、可降解性和可注射性，能夠有效的包裹MPEG-CPT并且體外緩釋超過30天。小鼠體內的抗腫瘤實驗表明載體和藥物P

3、EG化的特點及其組合非常有利于穩定CPT的內酯環，使其保持了活性，從而使得緩釋制劑具有良好的治療效果。從這個載體材料對于藥物包裹和緩釋的原理看，熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA共聚物不僅可以作為MPEG-CPT緩釋的載體，也期望可以作為其他PEG化藥物的通用的儲庫性局部給藥的緩釋載體。關鍵詞：聚合物；喜樹堿；可注射性材料；緩釋載體；熱敏凝膠化；PEG作者簡介：俞麟，男，博士，講師；*通訊聯系人：丁建東，教授、博導，E-mail: jdding1, Tel: fax:凝膠不僅是一種獨特的軟物質，還成為一種獨到的藥物緩釋載體材料1-3。

4、而近年來我們課題組在新型聚合物水凝膠的合成以及在藥物緩釋中的相關應用方面也取得了一些成績，形成了自己的一定特色4-9。有一種在人體或動物體溫附近為凝膠狀態，偏離人體或動物體溫時為溶液狀態的水凝膠材料近年來引起了人們的注意。這種可注射的熱敏水凝膠在偏離體溫時，以溶液狀態存在，在此狀態下可以包埋如藥物、細胞等生物活性物質；當注射于皮下組織、肌肉組織后，由于溫度的變化，包含有藥物的溶液迅速轉變為凝膠；藥物在擴散作用和凝膠自身降解作用雙重推動下，從凝膠內平穩釋放出來，達到了長效緩釋的效果5。在包埋過程中，由于沒有涉及任何有機溶劑，不易使包埋的藥物失活，并且其可注射性使得其無需手術，創傷小，這些均是其他

5、固體制劑不可比擬的優點。其中，聚氧化乙烯(PEO)-聚氧化丙烯(PPO)的共聚物（也稱為波洛沙姆，Poloxamer）已經商業化，并且由于其水溶液具有熱可逆的凝膠化行為具有作為可注射性藥物控釋載體的可能性，因而被廣泛研究。文獻報道了許多蛋白質、多肽藥物使用Poloxamer 407或Pluronic F-127作為緩釋給藥的載體，但是此材料從本質上講不具有可降解的化學基團，并且其在體內只能存在數天即被體液稀釋，無法達到長期給藥的效果，這些缺點限制了此類材料的實際應用。 近來，通過引入可降解的基團或組分到溫敏性的水凝膠材料中，科學研究工作者合成和制備了許多的可降解且溫度敏感的物理水凝膠材料，并且

6、此類工作已經成為近來研究的熱點之一10,11。例如，聚乙二醇（PEG）與聚（乙交酯-丙交酯）共聚物(PLGA)構成嵌段共聚物由于含有酯鍵，因此具有可降解性能。在嵌段比例、組成和濃度適當的情況下，此類共聚物具有溶膠凝膠相轉變行為，即在室溫時為流動的溶液，在人體溫度時轉變成為凝膠，是一類頗有應用前景的可注射性藥物輸送載體材料12,13。通過改變組成，如分子量和親疏水比例，還可以調節其降解速率，從而來調節釋放動力學，可以一次注射后緩釋藥物長達數周到數月。PEG既可溶于水，又可溶于絕大多數的有機溶劑，且生物相容性好，已被FDA批準用于人體。其端羥基進行活化后又易于和小分子藥物、蛋白質等進行鍵合。鍵合后

7、，PEG可將其許多優異性能賦予被修飾的物質。如PEG同藥物相連后能夠增加藥物的相對分子量，增加藥物的水溶性，減小腎消除，降低免疫原性，延長藥物半衰期，改善藥動學性質，降低毒性，提高體內活性等諸多優點。PEG修飾或PEG化是近30年來藥學和藥劑學研究的另一大熱點14-16。PEG/PLGA類水凝膠已經被報道且用于緩釋小分子和蛋白質藥物，而我們這里一方面研究了端基化修飾對于此類材料熱敏凝膠化性能的影響，另一方面利用該類水凝膠實施PEG化藥物的包裹和緩釋，第一次把此類載體材料的緩釋效果和PEG化藥物的長循環效果結合了起來。首先本文合成了一系列的熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物，系統

8、研究了端基化和嵌段長度對于熱敏凝膠化性能的影響；接著我們研究了PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝膠的體內外降解和材料的生物相容性；最后選擇喜樹堿（Camptothecin）合成了MPEG-CPT作為模型藥物，研究了包裹MPEG-CPT之后的體外緩釋行為、釋放機理以及體內的抗腫瘤的效果。實驗部分1試劑和藥品 喜樹堿（上海俊杰生物技術有限公司）；聚乙二醇（PEG）Mr = 1000、1500，單甲氧基聚乙二醇（MPEG）Mr = 5000均為sigma公司產品；乙交酯和丙交酯為Purac Co, PURASORB產品；其他藥品和有機溶劑均用分析純。動物：SD大鼠，雄性，約200 g，SPF

9、級別；KM小鼠，雌性，(192)，上海中科院實驗動物中心。2PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的合成對文獻方法進行適當改進后，合成了三種PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物13。3MPEG-CPT的合成首先根據文獻17的方法合成了MPEG5000-acid，接著在氬氣氣氛下，將MPEG5000-acid（0.5 mmol）溶于50 ml無水二氯甲烷中，然后把溶液溫度降到0后加入DCC（2.5 mmol）、DMAP（2.5 mmol）和喜樹堿（2.5 mmol），攪拌下在0反應2個小時，最后升溫到室溫繼續反應16個小時。反應完畢，0.1 N HCl洗幾次，分液，有機相用無水MgSO4干燥過

10、夜，過濾，減壓除去溶劑得到初產物，用DMF和乙醚重結晶得到一白色固體，進一步通過硅膠色譜除去殘存的喜樹堿。喜樹堿的PEG化程度通過文獻18的方法測定。4. PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物水溶液的相圖用試管倒置法19得到共聚物水溶液的sol-gel相轉變溫度。首先配制不同濃度的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液，然后在內徑為10 mm的4 ml試管中加入上述不同濃度的共聚物水溶液0.5 g，4冰箱中恒溫24 h。然后置于4的恒溫水浴槽中，每兩次升溫間隔為1，每個溫度試管恒溫15 min，而后180倒置試管30 s，觀察是否出現流動現象；如果30 s不流動，則認為發生了sol-ge

11、l相轉變。5PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物的體外降解在底部內徑為10 mm的10 ml試管中加入25 wt %的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液0.5 ml，然后放入37的恒溫水浴搖床中（35 strokes/min）。放置10 min后使其變為凝膠，然后加入3.5 ml pH為7.4的PBS溶液，每隔四天取一個樣，同時把其余樣品的溶液換為新鮮的PBS溶液以保持溶液的pH值在7.27.4之間；得到的樣品先冷凍干燥，然后用GPC進行測試，其中流動相為THF，標樣為聚苯乙烯。6PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物體內凝膠的形成和降解 首先用乙醚把大鼠麻醉，然后用5.5號針頭注射

12、0.5 ml的25 wt的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液到大鼠的頸部皮下。在不同的時間間隔，處死和解剖大鼠（n 3），觀察凝膠形態并且取凝膠周圍組織做組織切片以觀察炎癥反應。7體外緩釋MPEG-CPT在底部內徑為10 mm的10 ml試管中加入25 wt %的載藥的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液0.5 g，然后放入37的恒溫水浴搖床中（35 strokes/min）。放置10 min后使其成為凝膠；然后加入6 ml pH為7.4的PBS緩沖溶液，其中含有0.02 wt %NaN3和2 wt %的Tween-80，每次取樣為4 ml，同時加入同樣量的新鮮的PBS緩沖溶

13、液以保持漏槽的效果，取樣時間為1 h，2 h，4 h，8h，16 h，24h，48 h，72 h，然后每隔兩天取樣。以沒有載藥的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝膠作為空白參照，在同樣的時間間隔取樣。用Lambda 35紫外分光光度計在MPEG-CPT最大吸收峰368 nm處來定量樣品濃度，空白樣品用來扣除降解產物對于紫外測試的影響。同時，體外釋放數據用Higuchi方程20： (1) 或Peppas- Korsmeyer方程21,22： (2) 進行擬合。兩個方程中Q 是在t時間藥物的累積釋放量，k是動力學常數，即同擴散率也關，也同聚合物結構和幾何構型有關，n為釋放指數。8小鼠體內M

14、PEG-CPT的緩釋和抗S-180肉瘤活性取生長良好的7-11天的S-180瘤種，將瘤組織制成1-2107/ml細胞懸液，KM小鼠右側腋部皮下接種0.2 ml/只。接種24小時后隨機分籠，用5.5號針頭注射0.6 ml載藥的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液（copolymer-1，18 wt %）到小鼠的被部皮下，陽性藥5-FU于腫瘤接種后1、4天靜脈給藥共2次。七天以后處死動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重，求出腫瘤抑制率并進行t檢驗，優選出最佳治療組。 空白對照組平均瘤重-抑瘤組平均瘤重 腫瘤抑制率(%)= 100 空白對照組平均瘤重療效評價標準：腫瘤抑制率40%為無效; 腫

15、瘤抑制率40%，并經統計學處理與空白對照組p 0.05為有效。結果與討論1. PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物合成和表征PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物是以PEG為大分子引發劑，辛酸亞錫為催化劑，通過丙交酯和乙交酯的開環共聚反應得到。功能端基以及分子嵌段長度對于該聚合物材料的溶膠凝膠轉變及其其它性質有顯著影響，從而直接關系到能否作為一種物理凝膠包裹藥物以及是否具有可注射性；本文合成的三種嵌段共聚物的分子量參數見Table 1。Table 1. Molecular parameters of PLGA-PEG-PLGA triblock copolymersSample and Mn

16、a)PEG or MPEGMna)LA/GA(mol/mol)a)Mnb)(Mw/Mn)b)Copolymer-1: 1730-1500-173015001053101.19Copolymer-2: 1740-1500-174015005.055401.18Copolymer-3: 1400-1000-140010002.744601.21a) PEG的分子量由Aldrich提供；LA/GA的比例和PLGA嵌段的分子量通過1H-NMR確定；b) 三嵌段共聚物的數均分子量和分子量分布指數通過GPC測定。2. MPEG-CPT的合成、表征及其理化性質我們分兩步合成了PEG化的喜樹堿（MPEG-CP

17、T）；采用IR、1H-NMR、GPC、MALDI-TOF等進行表征，證實喜樹堿已經成功地被PEG化，并且其PEG化程度約為80。喜樹堿PEG化之后得到的MPEG-CPT在水中的溶解度大于150 mg/ml，遠遠大于喜樹堿本身在水中1.3 mg/ml的溶解度23,24；此外，由于MPEG是親水性的大分子，而CPT是一個疏水性的小分子，故得到的MPEG-CPT是一個兩親性的嵌段分子，可以在水中自組裝形成納米粒子，其中疏水的CPT在納米粒子的內部，親水的PEG在納米粒子的外部。3PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液的相圖三種PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液均具有溫度所依賴的sol

18、-gel相轉變行為。如Figure 1所示，在測試的溫度范圍內,隨著溫度的升高這些嵌段共聚物和水的共混物依次存在溶液態、凝膠態和再次的溶液態（這個溶液態最終趨于沉淀）。同時，凝膠態可以分為在相對低溫時的透明凝膠態和在相對高溫時的不透明凝膠態。由Figure 1中也可以看出，copolymer 3的sol-gel相轉變溫度低于室溫，而copolymer 2和copolymer 3的sol-gel相轉變溫度大于30。作為一種可注射的水凝膠材料，當其sol-gel相轉變溫度顯著低于室溫時，有可能在材料還沒有注射時已經粘度變大或凝膠化，導致注射難度增加或無法注射。因此同copolymer 3相比，co

19、polymer 1和copolymer 2更加適合作為可注射的水凝膠材料。Figure 1. Phase diagrams of PLGA-PEG-PLGA aqueous solutions. The legends represent copolymer samples listed in Table 1. Cross bars (+) indicates the temperatures above which the gel becomes opaque.4. PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物的體內外降解Figure 2表示了聚合物的Mn(t)/Mn,o比例隨降解過程發生的變化。結

20、果表明，三嵌段共聚物降解周期超過一個月；同copolymer 3相比，copolymer 1和copolymer 2降解速率相對較低。雖然copolymer 1和copolymer 2具有相近的分子量，但是LA/GA比例越高，嵌段的疏水性越強，結果導致copolymer 1具有相對緩慢的降解速率。Figure 3表明我們合成的聚合物水凝膠可以在大鼠體內存在超過三周。相應的組織切片表明凝膠周圍沒有顯著的炎癥反應，說明PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物體是一種具有良好的生物相容性和可降解性的水凝膠材料。Figure 2. In vitro degradation of PLGA-PEG-PLG

21、A in PBS. The legends represent copolymer samples listed in Table 1. Copolymer concentration is 25 wt %.Figure 3. A global observation of a physical gel formed underneath the skin of a rat. The image was taken 21 days after subcutaneous injection of an aqueous solution of PLGA-PEG-PLGA copolymer. Th

22、e gel region is emphasized by the dashed line.5. 體外緩釋MPEG-CPTFigure 4顯示了相同濃度不同組成的水凝膠體系體外釋放MPEG-CPT的動力學曲線。我們發現合適的聚合物水凝膠組成可以控制藥物的釋放超過30天。同時，MPEG-CPT釋放速度同聚合物水凝膠的降解速率相一致，即降解速度越低，累計釋放越緩慢。對藥物釋放第一階段的數據通過Higuchi方程或Peppas-Korsmeyer方程進行了擬合。相關釋放數據擬合的結果表明釋放體系均很好的符合Higuchi方程或PeppasKorsmeyer (n=0.5)方程，并且平方的相關系數值在

23、0.991-0.997之間。這些結果表明在藥物釋放的第一階段藥物的釋放基本由擴散控制，并且這一階段持續的時間相當的長。另一方面，對照MPEG-CPT從水凝膠中的釋放模型和PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝膠的降解動力學揭示在藥物釋放的第二階段應該由擴散和降解共同控制。Figure 4. In vitro release profiles of MPEG-CPT release from PLGA-PEG-PLGA hydrogel in PBS at 37 C. The legends represent copolymer samples listed in Table 1. Cop

24、olymer concentration is 25 wt % and drug-loading is 2% w/w. Each point represents the meanS.D.; n = 3.6. 小鼠體內MPEG-CPT的緩釋和抗S-180肉瘤活性 Table 2為18 wt的Copolymer-1三嵌段共聚物水凝膠包裹不同載藥量的MPEG-CPT在小鼠皮下注射，緩釋7天之后的抗S-180肉瘤結果。Figure 5為S-180肉瘤實驗結果示意圖。結果表明載體具有良好的緩釋效果，同時藥物劑量越高，治療效果越好；但是高劑量時藥物的毒副作用大，導致部分小鼠的死亡，而低劑量時，由于無法達

25、到治療所需要的藥物濃度，結果不能有效地抑制腫瘤。在合適的載藥量時，可以達到顯著的抗腫瘤效果。Table 2. In vivo anti-tumor effects of released MPEG-CPT against murine S-180 sarcoma組別劑量給藥途徑動物數體重 (g)瘤重 (g) (mean SD)抑瘤率 (%)p值開始最后開始最后NS-161619.534.32.080.58-5-FU50 mg/kg(a)i.p8819.328.90.810.1761.10.01載體+PEG3% w/ws.c8819.429.51.430.6331.3載體+MPEG-CPT0.5

26、% w/w (b) 9.31 mg/kg (c)s.c8819.329.01.610.6522.6載體+MPEG-CPT1.5% w/w 28 mg/kgs.c8819.428.10.730.3164.90.01載體+MPEG-CPT3% w/w 56 mg/kgs.c8519.024.00.560.3373.1a) 5-FU 給藥2次（腫瘤接種后第1天、第4天），每次的給藥劑量為50 mg/kg；b)表示MPEG-CPT在載體中的載藥量；c)表示所載的MPEG-CPT真正的實際的CPT（MPEG-CPT/CPT16/1）的給藥劑量。眾所周知，喜樹堿藥物存在一個重要的問題是在生理條件下不穩定，

27、其結構中的飽和內酯環具有pH依賴型，在生理條件下會迅速的開環成為羧酸鹽，導致藥物失活，但是當pH小于5.0的酸性環境中時其開環的部分可以恢復成為內酯結構25。一方面，藥物的PEG化不但解決了其溶解性差的問題，延長體內的半衰期，而且本文中的MPEG-CPT可以在水中形成納米粒子，納米粒子的結構顯然有利于穩定CPT的內酯環；另一方面，MPEG-CPT溶解到PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液中之后，可能大都以其同PLGA-PEG-PLGA纏結在一起形成膠束的形態存在，而PLGA-PEG-PLGA的整體疏水性遠遠大于MPEG-CPT，它們一起形成膠束時其核的疏水環境也應遠遠高于單獨MPEG-

28、CPT形成納米粒子的情況，這更加有利于穩定CPT的內酯環；此外PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的降解產物為羥基乙酸、乳酸和PEG，隨著降解的進行必然在凝膠內部形成一個偏酸環境，這一普遍被作為聚酯類材料的一大缺點卻在本文的緩釋體系中可能成為一個優點，其偏酸環境將有利于穩定CPT的內酯環。因此可見載體和藥物PEG化的特點及其組合非常有利于穩定CPT的內酯環，使其在長期的緩釋中保持了其藥物活性，顯示了良好的抗腫瘤效果。Figure 5. S-180 sarcomas captured at the 8th days after a subcutaneous injection of PLGA-

29、PEG-PLGA aqueous solution (18 wt % of copolymer-1) containing the marked amount of MPEG-CPT into mice.結論 不同組成的熱敏凝膠化的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物被合成和表征，體內外研究表明其具有良好的生物相容性、可降解性和可注射性。其水凝膠可以在體外緩釋PEG化的喜樹堿超過30天，相應的釋放機理的研究表明藥物釋放的第一階段由擴散控制，第二階段由擴散和降解共同控制。小鼠體內的抗腫瘤實驗表明制劑具有良好的治療效果，并且載體和藥物PEG化的特點及其組合非常有利于穩定CPT的內酯環，使其保持活

30、性。PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物不僅可以作為MPEG-CPT緩釋的載體，也期望可以作為其他PEG化藥物的通用的儲庫性局部給藥的緩釋載體。致謝本課題組工作得到自然科學基金(No. 50533010、No. 20574013、No. 20774020)、973項目(No. 2005CB522700)、教育部科學技術研究重大項目(No. 305004)、上海市科技發展基金(No. 07JC14005和 074319117)和上海市教委重點學科項目（No. B112）資助。參考文獻：1.Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications,

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