1、雞卵類粘蛋白的分離純化及活力測定時韋美 王宇 王彥坤 唐瑋 （河北大學 生命科學學院 08生物工程，河北 保定,071002）摘要：雞卵類粘蛋白(chickenovomucoid簡稱CHOM)是由雞卵清中制成的一種糖蛋白，它具有強烈的抑制胰蛋白酶的作用。采用有機溶劑沉淀法將雞蛋清經三氯乙酸（TCA）丙酮溶液處理，除去沉淀物，經丙酮分級沉淀活的粗品，再經過DEAE纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）柱層析純化而得合格產品，通過聚丙烯酰胺凝焦電泳進行雞卵類粘蛋白的活力測定。關鍵詞：雞卵類粘蛋白; 胰蛋白酶; 有機溶劑 ;層析; 電泳中圖分類號：Q 文獻標識碼：AThe isolation and pur

2、ification of CHOM and determined of its activityShi Wei-mei，Wang Yu，Wang Yan-kun，Tang Wei(Biology engineering in Grade 2008,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding,Hebei,071002)Abstract: chicken ovomucoid (CHOM) is a glycoprotein made of chicken-egg, it has a strong role in inhibiting tryp

3、sin. Using organic solvent like TCA-acetone solution to deal with chicken-egg, remove sediments by acetone, purify it through DEAE cellLose (2-ethyl ethyl cellLose ) column chromatograpHy, the activity is determined by PAGE.Key words: CHOM ;Trypsin ; organic solvent ; chromatogram ; electropHoresis;

4、雞卵類粘蛋白(chickenovomucoid簡稱CHOM)是由雞卵清中制成的一種糖蛋白，它具有強烈的抑制胰蛋白酶的作用1，常用于胰蛋白酶的酶學性質的研究。也可將其制成吸附親合劑，通過親和層析技術有效的分離和純化胰蛋白酶。卵類粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱度和高濃度的脲都是相當穩定的，在有機溶劑都有較高耐受性（在50% 丙酮或10% 三氯乙酸溶液中仍有較好的溶解度），而在堿性溶液中比較不穩定，尤其當溫度較高時易迅速失活。雞卵類粘蛋白的等電點有一定的范圍，大致在pH 3.94.5。分子量M 28000。采用有機溶劑沉淀法分級沉淀活的粗品。雞卵類粘蛋白具有強烈的抑制胰蛋白酶的作用;胰蛋白酶能水解酯鍵

5、,酰胺鍵和肽鍵,利用這一性質用人工合成的底物或天然的蛋白質可以測定胰蛋白酶的活力,由此可計算卵類粘蛋白的活力.。1 材料與方法 11 材料：111 試劑丙酮;0.5 M三氯乙酸;0.02 M,pH 6.5磷酸緩沖液;DEAE-纖維素;0.5 M氯化鈉-0.5 M氫氧化鈉溶液;0.5 M鹽酸;0.30 M氯化鈉-0.02 M,pH 6.5磷酸鹽緩沖液;1.0 M氯化鈉-0.02 M,pH 6.5磷酸鹽溶液;蔗糖;0.001 M鹽酸;ATEE-0.05 M,pH 7.0磷酸鹽緩沖液（每毫升磷酸鹽緩沖液含0.25毫克ATEE）;0.05 M,pH 8.0Tris-HcL緩沖液;結晶胰蛋白酶溶液（0.

6、001 M HCl配制）;a-胰凝乳蛋白溶液（用結晶0.001 M HCl 配制）;0.4 M Na2C03(無離子水配制);0.4 M 三氯乙酸;2% 酪蛋白溶液;Folin乙試劑;膠母液;10%過硫酸銨;pH 8.9Tris-HCl緩沖液;pH 6.7Tris-HCl緩沖液;pH 8.3Tris-Gly電極緩沖液;樣品液;0.05%考馬斯亮藍R250染液;脫色液112 器材新鮮雞蛋、恒溫水浴鍋、溫度計、抽濾瓶、布氏漏斗、透析袋、層析柱（1.0*20 cm）、可見分光光度計、部分收集器、紫外檢測儀（包括記錄裝置）、貯液瓶（柱層洗洗脫用）、秒表、垂直板電泳槽（六一產的）、凝膠膜（135*100

7、*1.0mm）、樣品梳、試管及試管夾、三角瓶、微量取樣器、平皿、廣泛pH試紙、移液管、高速冷凍離心機、電磁爐、直流穩壓電源、濾紙（7cm）12 方法：1.21 粗品的制備：(1)30.00 mL雞蛋清放于100 mL燒杯中；(2) 放置于溫水浴鍋內使溫度達到25-30，在不斷攪拌下加入等體積的4預冷的 三氯乙酸-丙酮溶液（體積比1：2），形成類似于酸奶狀的白色沉淀調pH到3-3.5，攪拌約30min，4下放置一小時1 ；(3) 4000r/min離心20min，得22.3mL黃綠色上清液于500mL燒杯中，邊攪拌邊加入2倍于上清液體積的4預冷的丙酮，產生白色沉淀，在冰箱中放置1小時，4000r

8、/min 離心20min，棄清液，沉淀物加入2mL離子水，溶解沉淀，裝入透析袋中對水透析以除去殘留的TCA,抽氣除去殘留丙酮。4000r/min 離心20min，棄沉淀，量取溶液體積為13mL。(4)加入1/10體積（即1.3mL）的0.2 M pH 6.5 PBS，搖勻，測量并記錄粗品體積14.3mL，供下步上柱純化使用。122 DEAE柱純化：(1) DEAE-纖維素的處理及再生（本步老師完成）新纖維素的處理：取50克DEAE-纖維素32，用少量水溶脹1小時，用0.5M氯化鈉溶液-0.5M氫氧化鈉溶液攪拌處理30min，用大量的蒸餾水洗至中性，再用0.5M鹽酸和0.5M氯化鈉溶液攪拌處理3

9、0min，用大量的蒸餾水洗至中性，再用0.5M氯化鈉溶液-0.5M氫氧化鈉溶液處理一次，最后用大量的蒸餾水洗至中性，放置冰箱中保存。舊纖維素的再生：只用0.5M氯化鈉溶液-0.5M氫氧化鈉溶液處理一次，用大量蒸餾水洗至中性，放置冰箱中保存。 （2）裝柱：層析柱垂直安裝在鐵架臺上。先加入1/2柱體積的水，取一合適的玻璃漏斗安裝在柱上端。將處理好的DEAE-纖維素連同水倒入漏斗，不斷攪拌使之自然沉降到1cm左右的高度。打開柱下端的硅膠管，攪拌至沉降到柱高的3/4高度(10.2cm)，將硅膠管連接在核酸蛋白檢測儀樣品池的入口，打開核酸蛋白檢測儀電源，預熱30分鐘。（3）平衡：用0.02 M pH 6

10、.5磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，用三倍柱體積的0.02 M pH 6.5磷酸鹽緩沖液平衡，連接核酸蛋白檢測儀，記錄流出速度（1.1mL/min）。始終保持柱床上有2cm高度的緩沖液，注意不能干柱。平衡過程中，調試核酸蛋白檢測儀。首先將旋鈕調到T100%，調“光量”到顯示100，再將旋鈕撥到A，調節“調零”到顯示0。繼續平衡，如數字有波動，反復調節，使A保持為0。 （4）上樣及洗脫：待柱床上方的緩沖液快流盡時，立即貼壁加1mL樣品，使樣品緩慢流下，再加0.02M pH6.5磷酸鹽緩沖液到柱上邊至2cm的高度。繼續平衡，觀察核酸蛋白檢測儀的A值變化。當A值急劇上升時，計時并記錄數值于表6中，收集流出液

11、。當A值上升到最高值時，計時并記錄數值，下降到數值保持穩定時改用0.3M氯化鈉-0.02M pH6.5磷酸鹽緩沖液洗脫1，同上，計時并記錄數值，收集流出液。脫過程中，根據吸光度值的變化收集蛋白峰，即為卵類粘蛋白部分。（圖1）將收集到的溶液放在透析袋中，先對水透析，再用蔗糖濃縮到2-3mL.1.2.3酶活力測定（1）粘蛋白對胰蛋白酶的抑制1和1：0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL）+0.5mL水；2和2：0.5mL粘蛋白粗品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），調pH=8.0 40保溫20分鐘；3和3：0.5mL粘蛋白純品+0.5mL胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL），調pH=8.0

12、 40保溫20分鐘。取6支試管，如上所述，使粗品和純品在PH8.0條件下，充分與胰蛋白酶結合，抑制其活性。經抑制后，按表1所列順序加樣。(2)胰酶及粘蛋白酶抑制劑后對酪蛋白底物的水解表1 胰蛋白酶及粘蛋白抑制后水解酪蛋白底物加樣表管號112233樣品（mL)1.01.01.01.01.01.040預熱5min0.4M三氯乙酸(mL)2.002.002.002%酪蛋白1.01.01.01.01.01.040繼續水浴10 min0.4M三氯乙酸(mL)02.002.002.040繼續水浴10 min ,7cm濾紙過濾，得濾液 (3)各管酶促反應濾液與Folin-酚試劑反應另取6支試管按表2加樣。表

13、2 各管酶促反應濾液與Folin-酚試劑反應加樣表112233表1濾液（mL）1.01.01.01.01.01.00.4M碳酸鈉（mL）5.05.05.05.05.05.0Folin乙試劑（mL）1.01.01.01.01.01.040水浴20min后，測定A680nmA680nm0？0？0？活力及剩余單位數（U）？粘蛋白抑制活力？注：在測定A680nm時，以1調0測1； 以2調0測2； 以3調0測3。(4)酶活力單位定義及計算公式酶活力單位U：40下，每min每mL酶液水解干酪素產生1微克酪氨酸所需的酶量。計算公式：酶活力單位=OD*4/10*n*kOD：1mL酶促反應液測得的OD680OD

14、: 1毫升酶促反應液測得的OD A680值；4：酶促反應體積；10：酶促反應時間;n：酶液稀釋倍數，（本實驗中n為1，各管內含胰蛋白酶均為1mL，2mg/mL的胰蛋白酶溶液）k：一個OD值相當于酪氨酸的微克數，本實驗取102。123 SDS-PAGE檢測雞卵類粘蛋白的純化與活性(1)配膠不加酪蛋白的分離膠的配制：確定所需凝膠溶液體積，在一小燒杯中按表3從上到下順序配制分離膠溶液。表3 10%分離膠的配制總體積5 mL30%膠母液（mL）1.65pH8.9buffer含SDS，TEMED（mL）1.25無離子水（mL）2.110%APS（L）40立即混勻，迅速將其灌注在玻璃板的縫隙內（約2/3高

15、），最后用微量取樣器將100L水加在膠液面上，約2-3mm厚水封隔氧。待分離膠完成后（約30分鐘后），傾出覆蓋水層，用濾紙吸凈殘留水。濃縮膠的配制：按表4數據配制表4 3.6%濃縮膠的配制總體積2 mL30%膠母液（mL）0.24pH6.7buffer含SDS，TEMED（mL）0.5無離子水（mL）0.910%APS（L）30在玻璃板上面1/3灌注濃縮膠。立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子，注意梳子正反面，小心避免氣泡，待凝。對樣品進行處理：粗品（25L）、純品(25L)、BSA(15L)分別與樣品處理液按體積比1：1混合，和Marker一起在100水浴加熱5分鐘，使蛋白質充分變性并與SDS結

16、合。 (2)點樣表5 點樣表點樣孔12345678910樣品粗品粗品粗品粗品MarkerBSA純品純品純品純品點樣量(L)10 6421620361020 (3)電泳將電泳槽和電源相連，調節好電源電壓100V，待樣品進入分離膠后調節電壓150V。待電泳完畢后，調節電壓為0，關閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，撬開玻璃板。取下凝膠，切下右下角做記號。放入平皿中。 (4)染色將考馬斯亮藍R250染色液加入平皿，沒過凝膠，脫色搖床震蕩染液10分鐘，用滴管將染色液回收到試劑瓶。（5）脫色用水洗去凝膠表面的浮色，棄水，加入脫色液，脫色至凝膠背景的藍色退去。測量相對遷移率，繪圖 (6)觀察結果掃描拍照，如圖

17、2。2 結果與分析 2.1 結果2.1.1雞蛋類粘蛋白的純化：對蛋白粗品進行離子交換層系的時候，每隔一段時間便記下吸光度的值，當吸光度的值達到一定高度不再上升反而下降時，及時地用離心管收集下當時的洗脫液，即收集蛋白峰所對應的蛋白卵類粘蛋白，已達到純化蛋白的目的。 在本實驗中，DEAE柱層析時洗脫液的流速為1.1 mL/min。表6 離子柱層析蛋白峰收集表時間吸光度時間吸光度時間吸光度時間吸光度時間吸光度時間吸光度0:00:0040:05:00810:10:00830:15:00600:20:00520:25:00380:00:1540:05:15760:10:15880:15:15760:20

18、:15580:25:15430:00:3040:05:30740:10:30800:15:30660:20:30500:25:30330:00:4540:05:45760:10:45800:15:45690:20:45510:25:45360:01:0050:06:00770:11:00640:16:00710:21:00460:26:00410:01:1570:06:15800:11:15660:16:15670:21:15470:26:15350:01:30120:06:30740:11:30700:16:30590:21:30520:26:30310:01:45210:06:45730:

19、11:45670:16:45660:21:45530:26:45350:02:00410:07:00660:12:00770:17:00710:22:00460:27:00370:02:15720:07:15640:12:15700:17:15600:22:15500:27:15280:02:30880:07:30670:12:30750:17:30630:22:30420:27:30330:02:45930:07:45800:12:45750:17:45540:22:45450:27:45340:03:00940:08:00720:13:00770:18:00510:23:00490:28:

20、00320:03:15940:08:15720:13:15640:18:15570:23:15420:28:15300:03:30940:08:30890:13:30750:18:30590:23:30440:28:30260:03:45930:08:45770:13:45720:18:45610:23:45450:28:45240:04:00950:09:00890:14:00750:19:00570:24:00360:29:00230:04:15980:09:15770:14:15710:19:15560:24:15430:29:15240:04:30970:09:30890:14:306

21、70:19:30580:24:30450:29:30290:04:45900:09:45870:14:45680:19:45510:24:45380:29:4523分析：（1）之前用0.02M pH6.5磷酸鹽緩沖液洗脫粗品時，吸收峰并無變化，一直維持在0水平，說明粗品基本已經除去；（2）吸收峰在迅速升起后，并為迅速下降，而是呈波浪型曲折下降，原因或為：加洗脫液時不穩定，造成壓力不恒定，致使流速不恒定而造成，洗脫液的成分有變化，有雜質，不純，造成洗脫不好，洗脫液配比并不適于此次洗脫加樣量過大，造成與柱結合的類粘蛋白較多，不易短時間內全部洗脫。改進：適量減少加樣量，使其易于全部洗脫；另外，做不同

22、濃度配比的洗脫液，使其更易于洗脫目標產物；加洗脫液時，盡量保持恒定速度，減少或降低不穩定因素。2.1.2 Folin-酚法測定胰蛋白酶的酶活力及卵粘蛋白的抑制活力(1)由酶活力的計算公式得 表7表7 酶活力及卵類粘蛋白的抑制活力表112233A680nm00.4000.3300.36活力及剩余單位數（U）16.32013.46414.688粘蛋白抑制活力2.8561.632(2)通過計算得純化總表,表8。總活力=總體積每毫升的抑制活力收率=純品的總抑制活力粗品的總抑制活力表8 純化總表步驟總體積/mL總活力/U收率丙酮-TCA粗提14.381.682100%DEAE-CellLose1.44.

23、5705.59%分析：活力也較低，原因或為實驗中間持續時間過長，類粘蛋白已有很大一部分失活；收率較低，原因或是DEAE-CellLose 中吸附有大量的類粘蛋白。改進：盡量縮短實驗時間，減少類粘蛋白的自然分解；或改進保存條件，使其自然分解減少；改進洗脫裝置。2.1.3 SDS-聚丙烯胺凝膠電泳測定類粘蛋白分子量 （1）經過考馬斯亮藍染色及脫色劑脫色，照相后結果如圖2：123 4 56 7 8 9 10圖2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖圖注：各泳道分別為 1：20L粗品； 2：10L粗品； 3：6L粗品； 4：3L粗品； 5：16L Marker;6:20L BSA; 7:3L純品； 8：6L純

24、品； 9：10L純品； 10：20L純品；染色結束后，測量蛋白質及示蹤染料的遷移距離，見表9。蛋白質的遷移距離是指從分離膠的起始位到蛋白質條帶的前緣。表9 各蛋白質遷移率及分子量BSA純品Marker123456平均距離（cm）1.001.750.551.001.452.002.502.60遷移率0.2900.5070.1590.2900.4200.5800.7250.754分子量6620034793 974006620043000310002010014400分子量對數4.82094.54154.98864.82094.63354.49144.30324.1584計算Rf值：Rf=蛋白質的遷

25、移距離/示蹤染料的遷移距離，蛋白質的前一距離為分離膠界面到蛋白質條帶的實際位置的距離。示蹤染液遷移距離Y=3.45cm，純品粘蛋白平均遷移距離X=1.75cm，Rf=0.507。 （2）繪制標準蛋白質分子量對數與相對遷移率的標準曲線本試驗使用的是第分子量標準蛋白Marker，由6種標準蛋白組成，以已知蛋白質分子量的常數值為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖，可得到一條直線，求出回歸方程。Marker的相對分子質量與Rf關系見表10 表10 Marker中蛋白的相對分子質量的對數與Rf的關系表蛋白質名稱兔磷酸化酶BSA兔肌動蛋白牛碳酸桿酶胰蛋白酶抑制劑雞血清溶菌酶分子質量97400662004300031

26、0002010014400相對分子質量的對數4.9884.8214.6334.4914.3034.158Marker中蛋白的相對分子質量的對數與Rf的關系可表示如圖3所示由圖中公式，y = -1.2929x + 5.197代入純蛋白遷移率，得純類粘蛋白的分子量為34793。分析：電泳條帶不齊，原因或為分離膠濃度不均，或倒膠時，里面的水未全部清除干凈，造成部分稀釋，導致此結果；部分背景呈暗色，原因或為脫色不完全，還留有考馬斯亮藍。改進：配膠時，搖勻，倒膠時，將水清理干凈；脫色時，加長脫色時間，并加大脫色液的用量。3 討論（1） 在向蛋清中加入有機溶劑（三氯乙酸-丙酮溶液（體積比1：2）時，要不斷攪拌，這樣，才能使蛋白充分分離，并