1、西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院第五節 DNA核酸序列分析返回目錄返回第二章西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院目的與要求目的與要求掌握DNA測序的一般原理和方法，通過學習，分析DNA策序與蛋白質策序的區別。重點：重點： Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法雙脫氧鏈終止法策序原理和方法難點：難點：如何根據凝膠電泳直接讀出如何根據凝膠電泳直接讀出DNA序列序列學時：學時：2學時學時學習方法：學習方法：課堂講授與討論相結合課堂講授與討論相結合西

2、北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.3.1 Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法 2.3.2 MaxamGilbert化學修飾法化學修飾法 2.3.3 序列分析自動化序列分析自動化2.3.4 雜交測序雜交測序2.3.5 DNA策序的商業運作及存在問題策序的商業運作及存在問題2.3.6 思考問題思考問題西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.1 Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當時在某些技術能力上和研年代末

3、就已掌握了充分的理論知識，只是當時在某些技術能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉變為現實。第一，究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉變為現實。第一，如何分離寡如何分離寡核苷酸片段核苷酸片段；另一方面，在；另一方面，在研究思路研究思路上都沒有擺脫蛋白質序列分析的束上都沒有擺脫蛋白質序列分析的束縛。縛。1965，Cornall大學以大學以SWHolle，為首的科學家小組，首次完成為首的科學家小組，首次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸個核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列測定。即利用各種的全序列測定。即利用各種RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸，經分離純化后，再分別測定短片段順序。降解成寡核苷

4、酸，經分離純化后，再分別測定短片段順序。返回返回DNA核酸序列分析歷程核酸序列分析歷程西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院1968年華裔生物化學、生物學家吳瑞博士（DrRay Wu） 獨創性地設計出一種嶄新的引物一延伸測序策略，并于1971年首次成功地測定了噬菌體兩個COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在該策略的基礎上，發展出了快速測定DNA序列的末端中止法；K. Mullis采納他的方法，完善了PCR擴增DNA的方法；MSmith發明了堿基定點突變技術。這三位科學家全都獲得了諾貝爾獎。引物引物延伸測序策略延

5、伸測序策略西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.1 .1 Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補鏈；2、利用2，3雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法，或酶催引物合成法。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院q反應：反應：同時加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一種種ddNTP、以及以及 四種四種dNTP（有一

6、種帶放射性標記）。q變性膠電泳變性膠電泳分離反應混合物。q放射自顯影術放射自顯影術，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。q結果判讀結果判讀，從放射性X光 底 片 上 ， 直 接 讀 出DNA的核酸順序。反應混合物中，標記什么最方便？反應混合物中，標記什么最方便？西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院GTACGTTGACGCCddATP ddTTPddGTP ddCTPddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC考考你考考你西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的

7、主要方法-生命科學院生命科學院酶、原料比例在實際的DNA合成反應中，使用失去了5 3核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當地調整ddNTP和dNTP的比例，便能夠獲得良好的電泳譜帶模式。dNTPddNTP=1：100時，譜帶分離效果較佳，可讀出多于 200個以上的核苷酸順序。降低ddNTP對dNTP濃度比，會產生逐漸加長的片段，再配合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出300個左右的核苷酸順序。dNTPddNTP與良好的電泳譜帶模式的關系如何？與良好的電泳譜帶模式的關系如何？西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的

8、主要方法-生命科學院生命科學院2.5.1.2 Sanger雙脫氧-M13體系 DNA序列分析法引物合成引物合成DNA序列測定法的特點及缺陷序列測定法的特點及缺陷分析分析：這樣處理后，能：這樣處理后，能策得高分子量策得高分子量DNA嗎？嗎？為了將這些降解的為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序片段，按其原來的順序“拼排拼排”起來，至少還需要用一種或數種其它內切限制酶，對起來，至少還需要用一種或數種其它內切限制酶，對同種同種DNA作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。實際上可行嗎？實際上可行嗎？高分子量高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制分子消

9、化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進一步分析。片段，供進一步分析。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院這些供作序列測定的這些供作序列測定的DNA片段絕大多數都僅片段絕大多數都僅為數百個核酸為數百個核酸。因此需要用物理方法分離大量的因此需要用物理方法分離大量的DNA片段。片段。費時費錢費時費錢，因，因為商品提供的核酸內切限制酶的價格是十分昂貴。為了保為商品提供的核酸內切限制酶的價格是十

10、分昂貴。為了保證能夠獲得所有的限制片段，就需要制備足多數量的證能夠獲得所有的限制片段，就需要制備足多數量的DNA，而其中有許多步驟都要用不同濃度的凝膠進行電泳再純化。而其中有許多步驟都要用不同濃度的凝膠進行電泳再純化。在這種純化過程中，會加劇在這種純化過程中，會加劇DNA的損傷和丟失。的損傷和丟失。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院克服缺點的一種途徑DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機地克隆到載限制片段，隨機地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈體分子上。選用天然的單鏈 DNA噬菌

11、體，例如噬菌體，例如 M13作為作為載體，重組體噬菌體的載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈噬菌體合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈噬菌體DNA中分離出來的一種限制片段。其中分離出來的一種限制片段。其特點是能夠特異性地同載體分特點是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點相連的單鏈子上與克隆位點相連的單鏈DNA區段雜交區段雜交。稱做。稱做“通用引物通用引物” 。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院M13載體克隆DNA片段將將DNA片段克隆在片

12、段克隆在M13mp載體特定位點上，即位于載體特定位點上，即位于 Lac區段中含有多克隆位點的多聚銜接物（區段中含有多克隆位點的多聚銜接物（polylinker）內。內。重組體噬菌體，在含有重組體噬菌體，在含有IPTG和和Xgal的培養基平板上形成的培養基平板上形成白色白色的噬菌斑，而非重組體的噬菌體則形成的噬菌斑，而非重組體的噬菌體則形成藍色藍色的噬菌斑。的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研

13、究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院當然這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復成原來結構形式的總DNA序列。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院使用M13載體系列的優點所有的待測定的所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。和分離各種不同引物的許多麻煩。最初使用的引物，是克隆在最初使用的引物，是克隆在PBR322質粒載體上的一種短的限制片段。以質粒載體上的一種短的限制片段。以后后J

14、Messing等人（等人（1981）發展出了一種更加適用的長度為）發展出了一種更加適用的長度為15bp的合成的合成引物，這段引物同引物，這段引物同M13的其它位點之間有的其它位點之間有低度的同源性低度的同源性，后來又合成出，后來又合成出了改進的同了改進的同M13其它任何位點其它任何位點均無同源性均無同源性的引物。的引物。現在，應用現在，應用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經成為一種載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經成為一種最普遍采最普遍采用的快速用的快速的的DNA序列分析法。序列分析法。 西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命

15、科學院2.5.1.3 Sanger 雙脫氧一pUC體系 DNA序列分析法自引入M13載體系列，DNA序列分析又有了新的改良和發展。起初起初是使用Klenow片段，現在現在則可以使用反轉錄酶或T7DNA聚合酶。以往以往都是把待測DNA片段克隆到M13mp載體上，得到單鏈模板后，再按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。現在現在，可以將待測DNA片段克隆到質粒載體上，直接用閉合環形的雙鏈質粒閉合環形的雙鏈質粒DNA按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。這種方法特稱為利用雙鏈質粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。由于通常使用的質粒多是pUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析

16、法。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院Sanger 雙脫氧一pUC體系 DNA序列分析法基本步驟待測待測DNA與與pBR322或或pUC分子分子重組重組；轉化轉化：轉化反應物涂布在補加：轉化反應物涂布在補加有有Xgal-IPTG選擇性培養基平板上，選擇性培養基平板上，經經37過夜培養；過夜培養；挑選白色菌落，挑選白色菌落，制備質粒制備質粒NA。堿變性處理堿變性處理，與引物一起退火，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。然后按雙脫氧法作序列分析。優點優點：無需將：無需將DNA克隆到克隆到M13載載體上，更為簡單快速，

17、現已被許體上，更為簡單快速，現已被許多研究工作者采用。多研究工作者采用。返回目錄返回目錄西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.2 MaxamGilbert化學修飾法是是1977年由美國哈佛大學的年由美國哈佛大學的AMMaxam和和W Gilbert 發發明的，所以又叫做明的，所以又叫做MaxamGilbert DNA序列分析法序列分析法雖然說對于大分子量的雖然說對于大分子量的DNA片段的序列測定而言，化學修飾片段的序列測定而言，化學修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發展速度也不及后者迅速，法并不如雙脫氧法方便有效，其

18、發展速度也不及后者迅速，但是至今在相當多的研究工作中仍被采用。但是至今在相當多的研究工作中仍被采用。返回目錄返回目錄西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.2.1 Maxam Gilbert化學修飾法的原理化學試劑處理化學試劑處理末端標記末端標記DNA片段片段，堿基的特異性切割堿基的特異性切割產生的產生的DNA片段混合物片段混合物,電泳分離顯影后顯現譜帶，直接讀出待測電泳分離顯影后顯現譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。片段的核苷酸順序。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學

19、研究的主要方法-生命科學院生命科學院出發材料出發材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端末端帶有放射性標記的DNA片段 (雙鏈或單鏈）關鍵：關鍵：4種核苷酸堿基中，有12種發生特異性的化學切割僅應，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環上轉移出去以及在失去堿基的部位發生DNA鏈的斷裂三個主要的內容。由于化學切割反應特異性是由堿基的修飾作用決定的，顯然，隨后的切割反應必定是定量的，而且同副反應無關。西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院堿基特異的化學切割反應肼專用試劑有專用試劑有硫酸二甲脂硫酸二甲脂和和肼肼。肼肼又叫做又

20、叫做聯氨聯氨（NH2NH2），），在堿性的條在堿性的條件下，它能夠從件下，它能夠從 C4和或和或 C6原子位置作原子位置作用于用于T和和C兩種堿基，并用兩種堿基，并用 C4-C5-C6環化環化形成一種新的形成一種新的 5原子環。聯氨的進一步作原子環。聯氨的進一步作用釋放出吡唑琳酮環用釋放出吡唑琳酮環，留下的嘧啶堿基的留下的嘧啶堿基的N1C2N3片段則仍然連接在糖環上。片段則仍然連接在糖環上。在具有在具有六氫吡啶六氫吡啶的條件下，通過的條件下，通過-消除反消除反應應，2個磷酸分子便會從糖片段上釋放出個磷酸分子便會從糖片段上釋放出來，從而導致在這個核苷酸位置上發生來，從而導致在這個核苷酸位置上發生

21、DNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。反應體系中加入反應體系中加入lmol/L濃度的鹽，濃度的鹽，肼肼同同T的反應速率便會逐漸下降，以確保發生的反應速率便會逐漸下降，以確保發生C特異的化學切割反應。根據這一特點區別特異的化學切割反應。根據這一特點區別C和和C+T之間的降解產物。之間的降解產物。 西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院硫酸二甲酯（CH3O）2SO2在在硫酸二甲酯硫酸二甲酯的作用下，的作用下，DNA堿基環堿基環中的氮原子發生中的氮原子發生甲基化反應甲基化反應（G N7原原子和子和A N3原子）。原子）。中性中性PH，甲基化

22、導致配糖鍵，甲基化導致配糖鍵水解水解，留，留下失去堿基的糖片段作為糖一磷酸骨下失去堿基的糖片段作為糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于通架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于通過堿催化的消除反應使圍繞在糖片段過堿催化的消除反應使圍繞在糖片段兩翼的兩翼的磷酸脫落，造成磷酸脫落，造成DNA斷裂斷裂。由。由于于A N3原子的甲基化比原子的甲基化比G N7原子慢，原子慢，故故3-甲基甲基A的配糖鍵比的配糖鍵比7-甲基甲基G脆弱。脆弱。所以前者的水解速率比后者快所以前者的水解速率比后者快46倍。倍。速率上的差別，是早期分析辨別速率上的差別，是早期分析辨別DNA中的中的G和和A的基本依據。最近采用六的基本依據

23、。最近采用六氫吡啶同氫吡啶同DNA甲基化反應，而這種反甲基化反應，而這種反應對甲基化的應對甲基化的G是特異的。因此，是特異的。因此，DNA鏈的斷裂只在鏈的斷裂只在G發生。發生。 西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.2.2 化學修飾法測序圖解西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院C T+C G+A AAACAGTCCTACCGCTGAAGCA G+A T+C C試試看試試看你作對了嗎？你作對了嗎？西北師范大學西北師范大學 第五章第五章 分子生物學研究的主要方法分子生物學研究的主要方法-生命科學院生命科學院2.5.2.3 MaxamGilbert化學修飾法優點不需要體外酶催合成反應不需要體外酶催合成反應單雙鏈都可以單雙鏈都可以需要末端標記需要末端標記兩端采用不同的標記，測序可從兩端進行兩端采用不同的標記，測序可從兩端進行返回目錄返回目錄西北師范大學西