1、樹舌子實體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究樹舌Ganodermalipsiense（Batch）G.F.Atk,.Syn.G.applanatum（pers.）Pat.;Elfvingiaapplanate（Pers.）Karst.又名“平蓋芝”、“扁靈芝”,屬靈芝科靈芝屬真菌,其全國分布廣泛;其性平,味微苦,在中醫(yī)中已有幾千年的藥用歷史。樹舌子實體多糖是樹舌的重要活性成分,具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫等多種生物活性,但在其抗腫瘤機制方面的深入研究不多,本論文主要通過四部分試驗研究以期闡明樹舌子實體多糖的抗腫瘤機制及抗腫瘤過程中的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。一:樹舌子實體多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表

2、征響應(yīng)面法和單因素試驗對樹舌子實體粗多糖的熱水浸提工藝條件進行優(yōu)化;所得樹舌子實體粗多糖通過DEAE-SepharoseFastFlow離子交換層析和SephacyralS-300HR凝膠柱層析繼續(xù)純化，得到多糖GAP-3s高效凝膠滲透色譜（HPGPC分析GAP-3s的分子量，高效液相（HPLC分析GAP-3s的單糖組成，并對GAP-3s進行紅外光譜分析。結(jié)果:單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化樹舌子實體粗多糖的熱水浸提工藝條件:液料比43（mL/g）、提取時間4.5h、提取溫度100,在此工藝參數(shù)下樹舌子實體多糖的提取率為5.03%;純化后所得樹舌子實體多糖GAP-3S勺分子量為6.82?10<s

3、up>5</sup>Da,主要由葡萄糖（60.1%）、半孚L糖（22.1%）、巖藻糖（9.3%）和木糖（8.5%）組成；紅外光譜分析顯示，GAP-3s含有B-味喃糖等結(jié)構(gòu)。二:GAP-3s對MCF-握田胞的作用不同濃度GAP-3S（0,125,250,500仙g/mL）處理MCF-7細胞后，通過MTTt測定MCF-割胞的增殖率；PI單染、Hoechst33258、AnnexinV-FITC/PI雙染等確定GAP-3s寸MCF-7細胞凋亡及細胞周期阻滯的影響；熒光定量PCRM定凋亡相關(guān)基因mRNA1達水平;WesternBlotting測定MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平;試

4、劑盒檢測Caspase-3、-8、-9蛋白活性。結(jié)果:GAP-3s能夠以劑量及時間依賴的方式抑制MCF-7細胞的增殖；Hoechst33258染色法、結(jié)晶紫染色法觀察細胞形態(tài)及細胞劃痕法觀察細胞遷移率等一系列形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明，GAP-3s能夠誘導(dǎo)MCF-7細胞出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、邊緣羽化及遷移能力下降，同時能使MCF-7細胞細胞周期發(fā)生G0/G1期周期阻滯、增加MCF-7細胞凋亡細胞比例；熒光定量PCPffiWesternBlotting結(jié)果表明GAP-3S|g夠顯著上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白P53、P21、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9和Cleved-PARP蛋白表達量，從基因和

5、蛋白水平確定GAP-3蘸夠誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡;GAP-3s同樣能夠增加Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,與上述蛋白表達測定結(jié)果一致,但Caspase-8活性無明顯變化，表明線粒體凋亡途徑可能在GAP-3sB導(dǎo)MCF-7細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。三:GAP-3s誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的線粒體機制13c劑盒測定不同濃度GAP-3S(0,125,250,500仙g/mL)處理MCF-7細胞后,MCF-7細胞的RO弟量、Ca²⁺fc®、線粒體跨膜電位、抗氧化酶活性的變化；WesternBlotting分析GAP-3s寸MCF-

6、7ffl月fiBax、Bcl-2、胞漿和線粒體中Cyt-C蛋白表達水平的影響；實時熒光定量PCRWJ定Bax和Bcl-2mRNAfe達水平。結(jié)果:GAP-3s能夠破壞MCF-7細胞線粒體膜電位，增加MCF-7細胞內(nèi)鈣離子濃度及RO的量；增加抗氧化酶SODGPX舌性，抗氧化劑GSK量上升;GAP-3s能夠顯著增加促凋亡蛋白Bax的mRNA口蛋白表達量，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRN相蛋白表達量，同時GAP-3蘸夠影響MCF-7細胞中Cyt-C亞細胞定位，促進Cyt-C由線粒體向胞漿中的釋放；以上結(jié)果提示，線粒體凋亡途徑在GAP-3s誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡過程中扮演重要作用。四:GAP-3s對M

7、CF7田月fiMAP奴NF-kB信號通路的影響試劑盒檢測GAP-3s處理MCF-7細胞后NF-kB核移位情況；WesternBlotting檢測IkB、P3&JNKERKRp-IkBp-P38、p-JNK、p-ERK的蛋白表達水平。結(jié)果：GAP-3s能夠增加MAPKSC族與炎癥和凋亡相關(guān)成員P3&JNK的磷酸化水平，降低與增殖分化相關(guān)成員ERK的磷酸化水平,表明MAPK妊GAP-3s刺?MMCFP-7細胞后胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用；GAP-3s能夠增加IkB蛋白的磷酸化水平，促進p65蛋白的核移位，從而激活NF-kB信號通路，表明NF-kB信號通路同樣參與了GAP-3SSRMMCF-7細胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。綜上所述，樹舌子實體多糖GAP-3s乍用MCF-7細胞后，能夠刺激MCF-7細胞產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)，MCF-7