1、q核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù)占第一節(jié)核酸分析技術(shù)講述內(nèi)容：1、核酸電泳2、雜交技術(shù)3、PCR技術(shù)4、基因芯片亠、核酸電泳 （） DNA的凝膠電泳 凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。1. 瓊脂糖凝膠用十分離大+ 200lOOObp的片段； 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5-500bp的片段；效果好、分辨率極高，相差lbp的DNA片斷就能分開, 能容納相對大量的DNA用于核昔酸多態(tài)性的分析士瓊脂糖凝膠電泳的基本過程 材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、澳化乙錠溶 液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳 時間的指示系統(tǒng)）、水平

2、凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)?；具^程：制膠一放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子二將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并 上樣于加樣孔中=> 一定電壓條件下電泳=>合適的時 間后停止電泳一 取出凝膠進行澡化乙錠染色n凝膠 成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果注意：漠化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套瓊脂糖濃度(, W/V)DNA分子的有效分離范圍(kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍右 影響DNA在凝膠中遷移速率的因素: 1 DNA分子的大小 2構(gòu)象 3凝膠濃度 4電壓5緩沖液q q q q工 q

3、q 9 n 9 oo O 寸 OO 一 e E TT瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡過程屮DNA Ladder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳聚內(nèi)烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析特殊的凝膠電泳倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（FIGE）:用于分離分子量102000kb的DNA分子；鉗位均勻電場電泳（CHEF電泳）：可 分離大于107bp的DNA分子（二0 RNA電泳基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點的是, 因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此 必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解；另外,因為RNA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳

4、結(jié)果，因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進行，常 用的變性劑為甲醛和戊二醛。士二核酸雜交技術(shù)() Southern Blot原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖 凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移 到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記 物標記的DNA或RNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針 互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針 洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢 的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是否有 點突變、擴增重排等。DNASouthern Blot

5、操作步驟:瓊脂糖電泳一印跡轉(zhuǎn)移一預(yù)雜交雜交(變性探針)一洗膜一放射自顯影或顯色51 rlcctruphorcsisDNA(?lc.<vc withrestriction vnzMDtsAlkaline Miluiion1>A fnigincnoBlotting:capillary action transfern» DM A from gel to filterFiller二火IFilterAutonidiogruphy（二）Northern Blot 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊 脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同 的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探

6、針進行雜交檢測。 用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA） 及其含量。操作過程mRNA提取一 甲醛變性電泳一印跡轉(zhuǎn)移一預(yù)雜交雜交（變性探針）一洗膜一放射自顯影或化學(xué)發(fā)光Th1 activityTh2 activitylulxrrculoidLcproniatousIXilxrrculoidLcpromaloustnf-P.IL-10£(三)探針標記技術(shù)丄標記物：放射性和非放射性兩種放射性：32p、35s和3h非放射性：生物素、地高索、熒光索 2、標記方法 (1)切口平移法 (2)隨機引物法 (3)末端標記法 (4)單鏈DNA探針標記-(5)寡核昔酸探針標記法PCR技術(shù) PC

7、R （Polymerase chain reaction）是用一對寡聚DNA作 為引物，通過加溫變性一退火一 DNA合成這一局期的 多次循壞，使忖的DNA片段得到擴增。由丁這種擴增 產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)2530個循環(huán)后，擴增 倍數(shù)可達106。 Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué) 獎;目的：用于擴增位于兩段已知序列Z間的DNA區(qū)段。（一）原理:雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補單鏈DNA變性I與一對募核甘酸引物（5，, 3，）降低溫度退火DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火適溫延伸卻/3,引物形成新鏈變成4條鏈DNA 一延伸I第二輪：變

8、性一退火一延伸 呈指數(shù)增長理論值：一輪一倍10輪12=1000倍20輪 10630 輪 109理論模板擴增30輪Inglg實際模板擴增30輪Ing10訊(二)基本要素 ITaq DNA聚合酶：水生棲熱菌(thermus aquaticusjaq)的DNA聚合酶5 ->3 DNA聚合酶活性；無外切酶活性，35輪625%錯配，與原始模板有差別；最適聚合酶溫度72C,選擇72°C延伸半衰期：92.5C 130min95*C 40min97.5°C 56min變性溫度：W95C使其在整個擴增循環(huán)中保持足夠活性土 pfu DNA聚合酚耐熱 5 3 DNA聚合酶活性 3,-5,外

9、切酶活性精確度：pfu >Taq但pfu擴增效率通常比Taq酶略差文獻報道：Taq+pfu會起到較好效果2 引物I人工合成短寡核昔酸20bp-25bp-Tin=55oC-60oC,hil0-50pmol /lOOjilF設(shè)計原貝i(1) 靠近5'上游Primer與雙鏈DNA正鏈相同3'下游Primer與雙鏈DNAil僭互補，與負鏈相同正鏈5,3'上游Primer下游Primer負鏈3*5*例如：IL-3正鏈5'GCTCCATGACCCAG GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'負鏈3'CGC7AGAAAACTCAGGTT 5'

10、上游：與其相同下游：先寫出相應(yīng)負鏈3*-*5'然后倒過來5'-3'(2)所以負鏈Primer： 5*-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3*Primer木身不要山現(xiàn)內(nèi)部互補序列形成loop環(huán)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如：GGGTCGATTCCTACCCATGC(3)注意減少Primer間互補序列導(dǎo)致2個Primer形成di mer般不要超過3個互補bp如：CCCATGCATGGAGTCGGGTCTATCAGTAAGC內(nèi)切酶識別點:(4) Primer 5未端可修飾、突變：修飾如：32p、生物素、熒光素，不影響其效果突變：AGCTCCATGACCCAG5VGCTCCA

11、TGACCCAG 3注意：絕不可以在3端進行上述改造VDNA聚合酶是5'f3聚介，若3端改造一不能互補一不能延仲(5) primer 5,端增加堿基.(G) GAATTCGC7TCCATGACCCAG f保護bp對PCR產(chǎn)物cloning有很大好處便于內(nèi)切酶消化，不同內(nèi)切酶需保護bp數(shù)疑不同EcoRI1BglH2-3Xbal2-3HindHI>3BaniHI2-3PstI>4Xhol>4Not!>10如果所用保護bp數(shù)量不合適一影響內(nèi)切舸消化一影響下步克隆 未切開，連接不上 ATG起始密碼 TAA、TAG, TGA終止密碼如：可溶性受體的表達，無膜內(nèi)區(qū)、穿膜區(qū)，

12、只有膜外 區(qū)。3模板:可選：DNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄一cDNADNA包括：質(zhì)粒 噬菌體染色體DNA較小較大H的gene是單拷貝變性較易 變性較難非常犬，變性難模板用量Plasmid:IngChromosome:300-500ng注意：防止交叉污染4. dNTP：四種脫氧核昔酸，基本原料終濃度：50pM注意：不穩(wěn)定，保存時間長會失效TaqDNA聚合酶作用時需要Mg"5. Mg2+不同的酶需不同MgMTaq：較少，Mg2*對反應(yīng)影響很大,0. 5-1. 5mM終濃度pfu： Mg" 2-3mM, dNTP、primer用量約增加一倍外界影響：EDTA養(yǎng)合Mg?+ 選較低濃度TE(1

13、0mM Tris, lniMEDTA)：DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團均可與Mg2*結(jié)介，降低Mg"有效濃度。如果擴增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度6.溫度和時間:（1）變性溫度:94-95 °CTemp let e： GC比例高、長度很長，則變性T t（2）退火：溫度越高，擴增特異性越好 取決于Tm值：Tm t退火T t ;Tm I退火T I若Tm較高,可使退火和延伸在同溫度（3）延伸：<500ntlmin >500nt3min一般：40 60sec& （三）PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因檢測： 2.基因克隆化 3. DNA突變4.

14、DNA序列分析U1基因芯片利用核酸雜交的原理，應(yīng)用于DNA、RNA的研究背景資料基因芯片(Gene Chip )就是利用點樣機等機械裝置，在玻璃 等支持物表而整齊地點上高密度的.成千上力個“點”,每個“點”含有 可與一種基因雜交的一條D N A探針。山于芯片上有序地排列著D N A探 針，因此也被稱為微陣列(Microarray)。在芯片上滴加樣品 后，在合適的條件下，樣品中含有的各種核酸片段(c DNA或c RNA) 就與和應(yīng)的探針雜交。III于核酸片段上已標記仃熒光索，激發(fā)后產(chǎn)牛的熒 光強度就與樣品中所含有的相應(yīng)核酸片段的量成止比，也就代農(nóng)該基因的 農(nóng)達量。經(jīng)激光共聚焦掃描儀等裝置掃描后，

15、所獲得的信息經(jīng)少用軟件分 析處理，即口J獲得成T上萬種基因的表達情況。正I大1為這種特點，基因芯 片技術(shù)已成為為前生命科學(xué)研究的熱點之一。£操作流程 (1)探針的設(shè)計、合成與芯片的制作(商品化產(chǎn)品)； (2)靶基因樣品的制備； 靶基因的制備：RT-PCR (設(shè)實驗組和對照組)-標記方法：分別進行熒光索標記如：Cy3和Cy5 (3)生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分/雜交過程基本相似 封閉預(yù)雜交雜交洗脫 (4)雜交信號的檢測與結(jié)果的分析 激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)收集熒光信號，計算機分析基因芯片的應(yīng)用誤于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測、基因組分析 和后基因組研究舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血

16、淋巴細胞cDNA 文庫中得到了 1046種cDNA片段，制成芯片.然后與熱處理的T淋 巴細胞和未處理的T細胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片 段雜交，經(jīng)激光共聚焦扌I描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個差異農(nóng)達的基 岡，其中11個是被熱誘導(dǎo)的，6個是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證 實，其屮3個是未報導(dǎo)的新基因。£第二節(jié)蛋白質(zhì)分析技術(shù)講述內(nèi)容：一、Western Blot二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù)五、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 一 Western Blot 1原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖 維索或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體

17、 進行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標 記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段 時間后再次洗滌去除非特界性結(jié)合的標記抗體，加入適 合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異 性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特 異性蛋白的半定量。右2操作過程 SDS-PAGE電泳一轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉 _. 一抗一洗滌 一酶標二抗反應(yīng)洗顯色或化學(xué)發(fā)光顯影Hours 04816kl)3217iiclinWestern blot analysis of the cleavage of Caspase-3IM9/Bcl-2 Cells were treated

18、with 20piM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treat me nt, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading controlWestern Blot analysis of cytochrome C release.X-ProteinCyto-CCytochrome c release from mit

19、ochondna to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with lOpM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.£ 3注意的問題 (1)蛋白質(zhì)電泳常用SDS-PAGE：單一亞星組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) T

20、ris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于lOkDa的多肽和 蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套右(2)轉(zhuǎn)膜戴手套，避免川手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會 阻斷轉(zhuǎn)E卩。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致以適量的轉(zhuǎn)移Buffe室溫平衡濾紙、凝膠和膜15-30min, 如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極-排去濾紙、膠和膜間的氣泡。-電轉(zhuǎn)時間：100Vl2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠川考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置（3）封閉用5 %脫脂奶粉或3%BSA（0.1%

21、Tween20 TBS或PBS配制）時間：室溫2h或4。（2過夜占（4）顯色或顯影顯色辣根過氧化物酶：底物為DAB堿性磷酸酚：底物為BCIP/NBT化學(xué)發(fā)光顯影最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品 化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定（5）膜的再利用化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer洗滌后 （洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2%SDS和 100mm的卩-2ME ）用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復(fù)使用34次。堿性磷酸酶

22、顯色的膜不能再進行雜交二、ELISA1原理： ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié) 合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的 抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時， 受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酚標記的 抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶 量與標木中受檢物質(zhì)的量呈一趙的比例。加入酶反應(yīng)的底物后， 底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直 接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具 有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。辣根過氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色,檢測波長492nmTMB,藍綠色，檢測波長450nm堿性磷酸酶，底物為PNPP （對一消基苯磷酸酯），黃色 檢測波長405nmELISA各步驟的反應(yīng)時間包被：24-36K,蛋白濃度為l-5ug/ml 封閉：37°C 2h 或0C過夜（3%BSA） 樣本反應(yīng)時間：37°C 45min-lh 酶標抗體反應(yīng)時間：37°C 45min-lh顯色時間：15min（避光） 設(shè)對照可以一次包被多塊板.凍存?zhèn)溆茫?）間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利川酶標記的