1、實驗內(nèi)容介紹實驗內(nèi)容介紹 實驗一、細胞及組織培養(yǎng)的準備工作 實驗二、培養(yǎng)基及胰酶的配制 實驗三、細胞的傳代（I）與凍存 實驗四、細胞復蘇及細胞鑒別與計數(shù) 實驗五、細胞原代培養(yǎng) 實驗六、細胞傳代（II）細胞爬片 實驗七、細胞骨架組分的熒光染色觀察 實驗八、考試動物細胞培養(yǎng)技術實驗內(nèi)容介紹實驗內(nèi)容介紹 實驗九、動物細胞的轉(zhuǎn)染與GFP的RNA干擾技術 實驗十、利用MTT比色法測定細胞群體的相對細胞數(shù) 實驗十一、探究實驗（綜合設計實驗） 實驗十二、探究實驗（綜合設計實驗） 實驗十三、掃描電子顯微鏡簡介 實驗十四、掃描電子顯微鏡生物樣品制備及觀察課程要求課程要求 一、遵守實驗室的各項規(guī)定 二、儀器使用要

2、遵守操作規(guī)則 三、上課不遲到、不早退、不無故曠課 四、上課時必須穿實驗服 五、服從研究生助教的指導和安排 六、按時完成作業(yè) 七、保護實驗環(huán)境、愛護實驗動物 八、實驗結(jié)束后，及時清理實驗用品 實驗考核方式實驗考核方式 平時成績 60 %，期末考試40 %平時成績：課堂操作，實驗習慣，合作精神， 實驗報告，課堂互動期末考試：組織培養(yǎng)技能考核：辨認細胞 實驗操作 總結(jié)報告：自主創(chuàng)新實驗收獲 科研小論文實驗一、細胞及組織培養(yǎng)的準備工作實驗一、細胞及組織培養(yǎng)的準備工作一、實驗原理一、實驗原理 1.體外培養(yǎng)（in vitro culture) 的基本概念: 將活體結(jié)構成分（甚至個體）從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出

3、，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。按照體外培養(yǎng)的結(jié)構成分，可將體外培養(yǎng)人為地分為： 組織培養(yǎng)（tissue culture） 器官培養(yǎng)（organ culture） 細胞培養(yǎng)（cell culture)一、實驗原理一、實驗原理 組織培養(yǎng)(Tissue Culture)是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在模擬體內(nèi)生理環(huán)境下，使之生存和生長并維持其結(jié)構和功能的方法。 細胞培養(yǎng)(Cell Culture)是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整

4、個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。一、實驗原理一、實驗原理 2. 組織細胞培養(yǎng)的優(yōu)點 能夠長時間觀察細胞的生命活動 容易控制實驗條件，有利于生物學研究 容易直接采集細胞及亞細胞結(jié)構的圖象 便于各種細胞染色處理和標記 培養(yǎng)細胞的單一性，有利于排除干擾因素一、實驗原理一、實驗原理 3. 體外培養(yǎng)技術的應用： 基礎研究：細胞生物學乃至整個生命科學研究中最基本的實驗技術之一。被培養(yǎng)的組織或細胞是良好的實驗材料。細胞培養(yǎng)廣泛應用于現(xiàn)代醫(yī)學和生物科學研究之中 生產(chǎn)實踐：疫苗生產(chǎn)、藥物研制與腫瘤防治等醫(yī)學實踐提供了全新的手段。一、實驗原理一、實驗原理 4. 細胞及組織培養(yǎng)的基本條件（1）無污

5、染的環(huán)境條件（2）適當?shù)臏囟?由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定,3537(人和哺乳動物細胞)（3）氣體環(huán)境與pH環(huán)境： pH7.2-7.4 (人和哺乳動物細胞)（4）營養(yǎng)條件（5）其它條件：等滲條件、附著底物一、實驗原理一、實驗原理 5.無污染的環(huán)境條件 凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染。（1）細胞污染的種類 A.物理污染: *溫度: 解決對策： 孵箱放在溫度較恒定的房間中培養(yǎng)液從冰箱取出后在室溫放置 *放射線與輻射:解決對策： 試劑周圍不能放同位素盡量不放在帶有玻璃門的冰箱中 *振動:解決對策：孵箱周圍不能放引起振動的設備 *其他：塵土、玻璃殘渣等.解

6、決對策：嚴格清洗 B.化學污染水: 解決對策：用雙蒸和三蒸水配液和清洗容器 （現(xiàn)在用純水儀millipore超純水） 容器: 生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留（鉛、砷）;消毒劑和清洗劑的殘留;鋁箔和包裹紙殘留 解決對策：培養(yǎng)用各種器皿的嚴格清洗（泡酸）培養(yǎng)箱:CO2混有有毒氣體; 消毒劑和清洗劑的殘留 解決對策：購置高質(zhì)量的CO2培養(yǎng)箱擦拭干凈一、實驗原理一、實驗原理 C.生物污染細菌、霉菌和酵母:易被發(fā)現(xiàn),易造成隱性污染病毒: 最難發(fā)現(xiàn)和清除,嚴格的宿主性,自限性支原體：污染嚴重,難發(fā)現(xiàn) ,難清除原蟲、昆蟲：其它細胞系：解決對策：實驗用品嚴格滅菌，無菌操作同一時間只傳同一種細胞,每種細胞要有單獨的液體

7、。建立細胞庫，每三個月更換一次細胞一、實驗原理一、實驗原理 6.清洗與滅菌除去各種玻璃或塑料器皿上對細胞生長有影響的各種雜質(zhì)以及消除附著在其上的各種微生物及化學物質(zhì)，改善玻璃表面性質(zhì)，有利于細胞的粘著和生長。 清洗和消毒是否徹底直接關系到體外培養(yǎng)的成敗。（1）清洗玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、吸管、滴管 、試管等浸泡 刷洗、烘干 浸酸沖洗（15遍自來水后3遍蒸餾水 倒置烤干 包裝干熱消毒膠塞（舊）：用加入適量洗滌靈的水溶液煮沸30分鐘，自來水沖洗 蒸餾水漂洗3次 晾干包裝 濕熱滅菌烘干備用膠塞（新）：水中浸泡 2%NaOH煮10-20min 自來水沖洗10次 1%HCl浸泡30min自來水沖10次，蒸餾水

8、洗3次 晾干 包裝 濕熱滅菌烘干備用。金屬器械 ： 自來水洗 75%酒精擦 濕熱滅菌、包裝 烘干備用或者自來水沖10次，蒸餾水3次 晾干 包裝 濕熱滅菌烘干備用一、實驗原理一、實驗原理（2）細胞及組織培養(yǎng)用品的包裝1局部包裝：濾器，培養(yǎng)瓶口2. 全包裝：膠塞、瓶蓋、金屬器械、注射器、小的瓶皿等（3）細胞及組織培養(yǎng)用品的消毒與滅菌射線消毒: 用鈷60等發(fā)出的射線消毒滅菌。 適宜用于量大或不適做高壓、干熱或過濾處理的培養(yǎng)用品，如塑料制品等。紫外線消毒: DNA損傷，臭氧，雙氧水 適用于空氣、主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒. 【注意事項】：空氣消毒時燈管應距地面25 m以

9、內(nèi)；臺面的消毒應在80 cm以內(nèi)；培養(yǎng)器皿的消毒在30 cm以內(nèi)。不要讓紫外線照射人的皮膚。一、實驗原理一、實驗原理干熱滅菌: 高溫變性， 160保溫90120 min 適用于玻璃器皿 【注意事項】溫度降至100之下才能開烤箱門。一、實驗原理一、實驗原理濕熱滅菌:高溫變性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分 適用于膠塞、瓶蓋、玻璃器皿、濾器、槍頭 塑料物品、PBS、LB等不易產(chǎn)生沉淀的液體 一、實驗原理一、實驗原理過濾除菌：采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，適用于培養(yǎng)基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等對熱不穩(wěn)定的試劑及藥物一、實驗原理一、實驗原理化

10、學消毒: 來蘇(0.3%)、新潔而滅（0.1%）、乙醇（70- 75%）、乳酸、過氧乙酸(0.5%)火焰消毒：僅限于無菌操作過程，在火焰近處并經(jīng)過燒灼進 行。用于培養(yǎng)瓶、滴管、試管、吸管等。 注意：等用品冷卻后放可接觸活的組織和細胞。抗生素的抑菌作用：青霉素、鏈霉素100單位/ mL培養(yǎng)基一、實驗原理一、實驗原理7. 平衡鹽DHanks緩沖液的配制 平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）主要是由無機鹽、葡萄糖組成。它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。 D-Hanks與Hanks的一個主要

11、區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。DHanks的配制 配方（1000 mL）：KCl 0.4g；KH2PO4 0.06 g； NaCL 8 g； Na2HPO4.12H2O 0.132 g；NaHCO3 0.35 g；酚紅0.02g（2%，1 mL）可不加酚紅一、實驗原理一、實驗原理二、實驗目的二、實驗目的 1.掌握細胞培養(yǎng)的基本概念 2.了解細胞培養(yǎng)的基本條件 3.掌握清洗和消毒的基本方法 4.學習DHanks液的配制方法三、實驗材料三、實驗材料1.細胞培養(yǎng)用品：玻璃器皿；濾器；塑料及橡膠制品 濾膜；棉花；酒精燈等2. 藥品及試劑：KCl ，KH2PO4 ， NaCL ，Na2HPO4， NaHCO3， 酒精、新潔爾滅等。四、實驗內(nèi)容四、實驗內(nèi)容無菌室及互動顯微鏡室、儀器的使用規(guī)則清點儀器設備針頭濾器的安裝與滅菌：安裝濾膜（0.22m光滑面朝上），高壓滅菌。DHanks緩沖液的配制及滅菌處理練習清洗培養(yǎng)瓶。練習包瓶子、塞子、插槍頭、切蓋玻片，移液管塞棉花等。75%酒精配制、酒精棉球制作以及酒精燈內(nèi)酒精添加。配新潔而滅消毒水。練習培養(yǎng)基瓶蓋的開啟與蓋上無菌室的打掃：自來水拖地、擦桌子及超凈臺，然后0.1%新潔而滅擦。 CO2培養(yǎng)箱滅菌：0