1、563ADxFLEX 流式細(xì)胞儀臨床應(yīng)用手冊目錄淋巴細(xì)胞亞群檢測3HLA-B27 檢 測6白血病和淋巴瘤免疫表型檢測8CD34+ 造血干細(xì)胞計數(shù)和檢測10陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的鑒別1254321淋巴細(xì)胞亞群檢測一、項目概述：可檢測淋巴細(xì)胞亞群（CD 4/CD3/CD 8 、C D19、C D56 等）、淋巴細(xì)胞活化（H LA- DR 、C D 69、CD45RA、CD45RO等）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD25bright/CD127dim）等等。淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，其測定值能夠反映機(jī)體的免疫功能狀況。因此在腫瘤患者免疫能力評價、自身免疫性疾病以及器官移植排斥反應(yīng)程度評價等方面有重

2、要參考價值。二、檢測指標(biāo)及臨床意義：進(jìn)展評價、免疫缺陷病、參考值引自：Reference Ranges for Lymphocyte Subsets among Healthy Flow Cytometry, W.S. Wong et. al., American Society for Microbiology, 2013Adults by Single-Platform3項目名稱檢測指標(biāo)臨床意義參考值范圍百分比(%)絕對計數(shù)(cells/µL)T淋巴細(xì)胞亞群總T細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)（CD3+) 總T淋巴細(xì)胞增高提示體內(nèi)的T細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，見于臨床某些自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE）、

3、慢性活動性肝炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、器官移植排斥反應(yīng)、T細(xì)胞白血病等；降低提示體內(nèi)T細(xì)胞免疫功能減弱，見于某些白血病，應(yīng)用免疫抑制劑、 、以及過勞等造成機(jī)體免疫功能處于相對較低的其他一些情況。 輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞減少常見于、遺傳性免疫缺陷 癥、應(yīng)用免疫抑制劑等；增高提示體內(nèi)細(xì)菌等病原微生物。 抑制/細(xì)胞毒性T細(xì)胞增多見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性活動性肝炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥、及其他等；減低見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 等。43.7-80.5711-2353輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)（CD3+CD4+)22.5-55.1368-1632抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)（CD3+CD8+)1

4、1.2-43.1201-931T4/T8細(xì)胞比值（CD4/CD8)0.63-3.39淋巴亞群(T、B、NK)NK細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)(CD3-CD56+)B細(xì)胞增多見于各種自身免疫性疾病，如風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、SLE活動期、 甲狀腺炎等，還見于某些病原微生物 、慢性B細(xì)胞白血病等；減少提示機(jī)體體液免疫功能被減弱，見于嚴(yán)重的染、免疫抑制藥使用等。NK細(xì)胞NK細(xì)胞與機(jī)體抗各種病原微生物、腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；腫瘤患者NK細(xì)胞較正常人減少；病情好轉(zhuǎn)，NK 水平可回升。4.4-21.274-534B淋巴細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)(CD3-CD19+)3.7-46.163-1013總T細(xì)胞百分比及絕對計數(shù)(C

5、D3+)43.7-80.5711-2353T淋巴細(xì)胞活化及分化活化T細(xì)胞百分比(CD3+CD25+)CD25：IL-2S受體，表達(dá)于活化T 細(xì)胞活化T細(xì)胞增加，提示機(jī)體免疫應(yīng)答活動增強(qiáng)，見于病原微生物等免疫功能被激發(fā)的情況，活化T細(xì)胞檢測在器官移植后免疫功能監(jiān)測和術(shù)后監(jiān)測中有重要意義；HLA-DR：MHC類分子，起抗原呈遞作用，在T、NK細(xì)胞為活化標(biāo)志；CD3+CD45RA+：初始T淋巴細(xì)胞，提示T細(xì)胞生成與減少；CD3+CD45RO+：記憶T淋巴細(xì)胞，在性疾病，特別是急染性疾病會增高，相反在慢染性疾病中反而降低。15.9±3.7活化T細(xì)胞百分比(CD3+HLA-DR+)3.1

6、77;1.3初始T細(xì)胞百分比(CD3+CD45RA+CD45RO-)20.51±3.64記憶T細(xì)胞百分比(CD3+CD45RA-CD45RO+)3.3±1.5511三、實驗1. 流式試劑1）tetraCHROME CD45/CD4/CD8/CD3試劑盒2）tetraCHROME CD45/CD56/CD19/CD3試劑盒3）OptiLyse C溶血素、鞘液、液等2. 樣本1）按照說明書，分別編好號的試管中加入10 µL混合抗體；2） 分別向試管中加入混勻的100 µL血；3） 混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘；4） 溶血：加入500µLOpt

7、iLyse C溶血素，避光溶血10min；5） 可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣。3. 上機(jī)檢測開啟DxFLEX流式細(xì)胞儀，打開CytExpert，調(diào)取已保存淋巴亞群檢測方案，添加新試管，開始獲取，根據(jù)實際圖形適當(dāng)調(diào)節(jié)門的位置，4. 結(jié)果演示結(jié)果。4組成克隆號同型對照規(guī)格CD45-FITCCD19-ECD CD3-PE-Cy5B3821F4AJ3-119 UCHT1IgG2b(mouse)IgG1(mouse) IgG1(mouse)1 瓶 /50 測試CD56-RD1N901IgG1(mouse)組成克隆號同型對照規(guī)格CD45-FITCCD8-ECD CD3-PE-Cy5B3821F4ASFC

8、I21Thy2D3 UCHT1IgG2b(mouse)IgG1(mouse) IgG1(mouse)1 瓶 /50 測試CD4-RD1SFCI12T4D11IgG1(mouse)1四、推薦試劑：5檢測項目品名貨號狀態(tài)規(guī)格T 淋巴亞群CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC56607013CFDA50testsCD45-FITC/CD4-PE/CD3-PC56607015CFDA50testsCD8-APCIM2469CFDA100tests淋巴細(xì)胞亞群 TBNKCD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC56607073CFDA50testsCD3-

9、FITC/CD(16+56)-PEA07735CFDA50testsCD19-APCIM2470CFDA100tests淋巴細(xì)胞活化檢測CD3-FITCA07749CFDA100testsCD25-PEA07774CFDA100testsCD4-PC5IM2636CFDA100testsCD45-PC7IM3548CFDA100testsCD3-FITC/HLA-DR-PEIM1295UCFDA50tests記憶 T 及幼稚 T 檢測CD45RA-FITCA07786CFDA100testsCD45RO-PEA07787CFDA100testsCD3-PC5A07752CFDA100tests

10、T8 淋巴細(xì)胞活化檢測CD38-FITCA07778CFDA100testsCD8-PEA07757CFDA100tests絕對計數(shù)微球Flow-Count Fluorospheres7547053CFDA20mL/200tests溶血素OptiLyse C No-Wash Lysing SolutionA11895CFDA200tests2HLA-B27檢測一、項目概述及臨床意義：強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性炎性疾病，主要骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，并可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。已證實AS的發(fā)病和HLA-B27表達(dá)密切相關(guān)，并有明顯家族聚

11、集傾向。使用流式細(xì)胞儀對人外周血中淋巴細(xì)胞表面HLA-B27 抗原表達(dá)進(jìn)行檢測，以輔助該疾病的。HLA 是人類主要組織相容性復(fù)合物（MHC）的表達(dá)產(chǎn)物，在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識別和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。HLA-B27抗原屬于型MHC，基本上表達(dá)在機(jī)體所有有核細(xì)胞上，尤其是 淋巴細(xì)胞表面含量豐富。在我國HLAB27+人群中，約有10%的人呈現(xiàn)HLAB7+，為雜合位點或交叉反應(yīng)，導(dǎo)致部分檢測的假陽性。HLA-B7與HLA-B27同屬于HLA-B抗原，于所有有核細(xì)胞表面，血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞。因此，在試劑盒中除了有抗HLA-B27單克隆抗體，還應(yīng)加入抗HLA-B7單克隆抗體，來

12、排除因B7交 叉反應(yīng)造成的假陽性結(jié)果。二、實驗：1. 流式試劑1）IOTest®HLA-B27 FITC/HLA-B7 PE2） OptiLyse C溶血素、鞘液、2. 樣本液等1）按照說明書，分別編好號的試管中加入20 µL上述抗體和同型對照抗體（IgG2a-FITCIgG1-PE）；2） 分別向試管中加入混勻的100µL血；3） 混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘；4） 溶血：加入500µLOptiLyse C溶血素，避光溶血10min；5） 洗滌后上樣。3. 上機(jī)檢測開啟DxFLEX流式細(xì)胞儀，打開CytExpert，調(diào)取已建立HLA-B27檢測方

13、案，添加新試管，開始獲取，根據(jù)實際圖形適當(dāng)調(diào)節(jié)門的位置，4. 結(jié)果演示結(jié)果。病例6組成克隆號同型對照規(guī)格HLA-B27-FITC HLA-B7-PEHLA-ABC-m3 BB7.1IgG2a(mouse) IgG1(mouse)1 瓶 /50 人份2陽例三、結(jié)果陰陽性：HLA-B27陽性而HLA-B7細(xì)胞群的百分比>90%。四、推薦試劑：7HLA-B27-FITC/HLA-B7-PEA07739Mouse IgG2a/lgG1CFDA50 testOptiLyse C No-Wash Lysing SolutionA11895CFDA200 testDuraClone B27B36862

14、clone(UCHT1/FD705/ABCm3/BB7.1)CE50 testCD3PE Dyo649(PC5) HLA B27(ABCm3)PE HLA B27 (FD705)PEB7Unlabeled 抗體內(nèi)參微球50 管DuraLyse Solution50 test3白血病和淋巴瘤免疫表型檢測一、項目概述：流式細(xì)胞術(shù)（FCM）白血病淋巴瘤免疫分型是利用不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化 程度。二、臨床意義：正常情況下，造血系統(tǒng)的各類細(xì)胞在發(fā)生發(fā)育過程中有其固有的抗原表達(dá)規(guī)律

15、。而在白血病狀態(tài)下，白血病細(xì)胞本身雖然未發(fā)現(xiàn)特殊性的白血病抗原，但其抗原表達(dá)的正常規(guī)律遭到破壞。免疫分型的原理之一是基于白血病細(xì)胞的分化阻滯學(xué)說，即白血病細(xì)胞僅出現(xiàn)某個細(xì)胞發(fā)育階段（常常為幼稚期的）抗原表達(dá)特征而使患者白細(xì)胞的正常表達(dá)抗原譜出現(xiàn)中斷（阻滯）現(xiàn)象。同時白血病細(xì)胞的抗原表達(dá)還可能出現(xiàn)異常的組合， 如早期抗原和晚期抗原同時表達(dá), 髓細(xì)胞抗原和淋巴細(xì)胞抗原的共表達(dá)等。依據(jù)其抗原表達(dá)譜不但可以準(zhǔn)確白血病的細(xì)胞來源（髓系，淋系，紅系，單核系，巨核系或漿細(xì)胞），進(jìn)行免疫分型, 還常?？梢哉_某些白血病的核型（如與11q23有關(guān)的急性淋巴細(xì)胞白血病常常有特定的CD19+，CD10-，CD15+

16、抗原譜）。淋巴細(xì)胞在發(fā)育的各個階段都可以發(fā)生惡變，如果是在早期發(fā)生惡變，并進(jìn)一步的發(fā)展，則會產(chǎn)生一種叫做淋巴細(xì)胞性白血病的血液病，它可以 到骨髓，血液以及組織，這些細(xì)胞反映的是原始淋巴細(xì)胞的抗原表達(dá)。當(dāng)淋巴細(xì)胞在成熟以后發(fā)生惡變，惡性細(xì)胞表現(xiàn)出成熟細(xì)胞的表型。如果這些分化的淋巴細(xì)胞到淋巴結(jié)或其他的淋巴組織或器官，則稱為淋巴瘤。但淋巴瘤和淋巴細(xì)胞白血病的區(qū)別并不是很明顯，因為惡 性細(xì)胞可以同時 組織和血液。流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為淋巴系統(tǒng)腫瘤臨床評價非常必要的工具，該技術(shù)可以幫助 和鑒別淋巴瘤和CPLD等疾病。尤其在評價B細(xì)胞克隆性方面，能夠提供明確的免疫球蛋白限制性的證據(jù)；在評價T細(xì)胞克隆性方面，很

17、難用傳統(tǒng)的標(biāo)志去分析T細(xì)胞的克隆性，但T細(xì)胞受體（TCR）基因重排的分子生物學(xué)分析可以確定T細(xì)胞的克隆狀態(tài)，用流式檢測V受體庫可以成為非定量的分子克隆性研究的替代方案。目前公司生產(chǎn)出一種商品化的試劑盒用于檢測TCR V受體庫，這個試劑盒8瓶試劑，可以檢測24種TCR V，對于和檢測T細(xì)胞具有極大的作用。多參數(shù)流式細(xì)胞分析術(shù)為白血病和淋巴瘤的和治療提供了重要的依據(jù)。在最近二十年的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實踐中，白血病和淋巴瘤的治療已經(jīng)有了很大的提高，多參數(shù)流式細(xì)胞分析術(shù)則是為現(xiàn)代白血病治療配套的必備技術(shù)。根據(jù)WHO對白血病的最新，白血病細(xì)胞免疫表型分析是血液不可或缺的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，并且對臨床治療有關(guān)鍵的指導(dǎo)意義

18、。流式細(xì)胞術(shù)的多參數(shù)分析白血病細(xì)胞免疫表型，可了解被測細(xì)胞所屬 的細(xì)胞系列及其分化程度。尤其在下列情況下意義更加突出：1. 快速篩選除外急,慢性白血病,淋巴瘤,骨髓瘤及高危性MDS。2. T細(xì)胞白血病的及鑒別。3. 各種血液系統(tǒng)(白血病或淋巴瘤)的及準(zhǔn)確分型。4. 已知急，慢性白血病的進(jìn)一步分型，預(yù)后和追溯。5. 形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。6. 型白血病混合性白血病。7. 微小殘留白血病。8. 骨髓瘤和漿細(xì)胞白血病的及鑒別。三、實驗：1. 五色干粉試劑方案8管號標(biāo)記FITC 熒光PE 熒光ECD 熒光PC5 熒光PC7 熒光1-IsotypeIgG1IgG1IgG1IgG1

19、CD452-T subsetCD8CD4CD3CD56CD453-B ClonalityKappaLambdaCD20CD19CD454-Pan B MarkerCD5CD10CD20CD19CD455-BlastHLA-DRCD33CD34CD117CD456-Plasma CellCD38CD138CD19CD56CD457-Myeloid MarkerCD11bCD13CD16CD15CD458-Moncytic MarkerCD14CD64HLA-DRCD34CD459-Pan T MarkerCD5CD7CD3CD2CD45Viability 測定胞內(nèi)特異性加做CD71TdT or

20、cCD3CD235a MPOCD41設(shè)門抗體7-AAD CD79aCD45 CD4532. 樣本1） 直接在Duraclone試管中加入50µL骨髓樣本；2） 充分混勻，避光孵育20-30min；3） 使用VersaLyse溶血素，避光溶血15min；4） 洗滌后上樣。3. 上機(jī)檢測開啟DxFLEX流式細(xì)胞儀，打開CytExpert 開始獲取，根據(jù)實際圖形適當(dāng)調(diào)節(jié)門的位置，4. 結(jié)果演示，調(diào)取已建立免疫分型檢測方案，分別添加相應(yīng)新試管，結(jié)果，也可用kaluza進(jìn)行分析。以上結(jié)果來源于一例B-ALL骨髓標(biāo)本，用上述五色方案，在DxFLEX流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，P2門（紅色）為異常細(xì)胞群

21、，表達(dá)CD19，CD34，HLA-DR，CD20，CD10；不表達(dá)CD33，CD117，CD2，CD3，CD5，CD7，CD38。結(jié)果用CytExpert四、八到十色免疫分型方案：分析。9CLL-1FITCPEECDPC5.5PC7APCAPC- A700APC- A750PacBlueKrome OrangeFMC7CD10CD5CD79bCD20CD23CD19IgMCD45CLL-2kappalambdaCD38CD25CD11cCD103CD19CD22CD45CLL-3CD8CD4CD3CD56CD19HLA-DRCD45PlakappalambdaCD19CD117CD56CD13

22、8CD38CD20CD45T-1CD79bCD1aCD7CD56CD3CD4CD8CD16CD57CD45T-2TCRa/bCD30CD7TCRg/dCD2CD4CD8CD19CD5CD45CyTdTMPOCD22CD34CD79aCD3IgMCD45AML-1CD64CD34CD4CD33CD19CD56CD14HLA-DRCD45AML-2CD65CD34CD117CD13CD2CD7CD11bCD15CD45AML-3CD717.1CD38CD61CD36CD235aCD14CD45MDS-1CD14CD13CD38CD123CD117CD11bCD34CD33CD16CD45MDS-2

23、CD71CD4CD64CD56CD117CD36CD34CD33HLA-DRCD45MDS-3CD7CD10CD8CD5CD2CD3CD34CD19CD15CD45CLL-cykappalambdaZap-70CD79aCD5CD3CD454CD34+造血干細(xì)胞檢測和計數(shù)一、項目概述：造血干細(xì)胞是一群在骨髓和外周血中未成熟的造血細(xì)胞，具有造血潛能，多能和定向祖細(xì)胞，膜上主要表達(dá)CD34+。正常骨髓單個核細(xì)胞中造血干細(xì)胞約占1-4%。在臨，外周血骨髓干細(xì)胞移植（peripheralblood stem cell transplantation）列入常規(guī)療法，在部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)，外周血骨髓干細(xì)胞移植已

24、成為骨髓破壞性治療后（myelo-ablative，例如放療或化療），重建病患造血功能及免疫系統(tǒng)的第一選擇。二、臨床意義：· 指導(dǎo)臨床造血干細(xì)胞的計劃· 確定不同來源的造血干細(xì)胞移植用量· 臨指導(dǎo)化療劑量，血象的恢復(fù)快慢取決于化療對造血干祖細(xì)胞損傷的強(qiáng)度· 貧血的鑒別（如再障、缺鐵性貧血）· 臍血保存與檢測三、實驗：1. 流式試劑1）Duraclone S34 干細(xì)胞計數(shù)干粉試劑盒2. 樣本1） 按照說明書，直接在Duraclone試管中加入50µL骨髓樣本，注意采用反式加樣法；2） 充分混勻，避光孵育20-30min；3） 使用Du

25、raLyse溶血素，避光溶血15min；4）2小時內(nèi)上機(jī)檢測。3. 上機(jī)檢測開啟DxFLEX流式細(xì)胞儀，打開CytExpert，調(diào)取已建立CD34+計數(shù)方案，添加新試管，開始獲取，根據(jù)實際圖形適當(dāng)調(diào)節(jié)門的位置，4. 結(jié)果演示統(tǒng)計結(jié)果。1050 管 /50 人份CD45-Atto*488H130IgG1 MouseCD34-PE581IgG1 Mouse絕對計數(shù)微球DuraLyse Solution1 瓶 /25mL7-AAD組成克隆號同型對照規(guī)格4設(shè)門策略：1）CD45/SS：來源于LIVE門，WBC門活性的淋巴細(xì)胞；所有有活性的CD45表達(dá)的細(xì)胞，dimCD45。Lym門為所有有2）CD34

26、/SS：Gated from WBC。CD34+門所有CD34+細(xì)胞，從低SS到中等SS強(qiáng)度；3）CD45/SS：Gated from WBC+CD34+門。CD45dimCD34+門確認(rèn)CD34陽性細(xì)胞位于低CD45與低SS區(qū)域，為真正CD34+細(xì)胞；4）FS/SS：Gated from Lym門。P6門了淋巴細(xì)胞，不細(xì)胞碎片；5）FS/SS：Gated from WBC+CD34+CD45dimCD34+門。Viable CD34+從P6門而來，為正活性的CD34+干細(xì)胞；6）7-AAD/CD45：Gated from P7門。用于確定微球的位置；7）CD45/CD34：Gated fro

27、m LIVE門。用于補(bǔ)償調(diào)節(jié)及確認(rèn)所有的CD45陽性細(xì)胞，確定WBC門的下限。結(jié)果通過：自動計算，可得到ViableCD34+絕對含量為597cells/µL，占所有白細(xì)胞比例為0.61%，所有活細(xì)胞百分比為85.32%。四、推薦試劑：11品名貨號克隆號狀態(tài)規(guī)格DuraClone S34B36863CE50 testCD45Atto488(FITC)clone H13050 tubeCD34PEclone 5817-AADDuraLyse Solution50 testStem Kit-CD34+HPC（干細(xì)胞計數(shù)試劑盒）IM3630IVD&CE50 testsCD45-FI

28、TC/CD34-PE50 testsCD45-FITC/IsoClonic Control-PE50 tests7-AAD Viability Dye1 vial10X NH4Cl Lysing Solution2 vialsStem-Count Fluorospheres1 vialCD34-PEA07776clone 581CFDA100 testsCD45-PC5A07785clone J.33CFDA100 tests7-AAD Viability DyeA07704CFDA150 testsFlow-Count 計數(shù)微球7547053CFDA20mL5陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的鑒別一、

29、項目：陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH）是以補(bǔ)體介導(dǎo)的血為特征的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病。以糖基磷脂酰基醇（glycosyl-phosphatidyl ionositol, GPI)內(nèi)溶缺陷，導(dǎo)致PNH患者的血細(xì)胞膜缺乏GPI連接蛋白，采用熒光標(biāo)記GPI相關(guān)抗體，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測缺乏這些 膜蛋白的異常細(xì)胞，并計算出異常細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，能夠客觀地異常細(xì)胞群和GPI蛋白缺乏的種類與程度。與傳統(tǒng)的補(bǔ)體相關(guān)溶血實驗相比，流式細(xì)胞術(shù)是PNH二、臨床意義：的性進(jìn)步，成為PNH的直接依據(jù)。1、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的與鑒別。2、陣

30、發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿高危人群的篩選。3、再生性貧血（AA）和骨髓異常增生綜合癥（MDS）患者PNH克隆的。檢測目的細(xì)胞紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，也有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞膜錨定蛋白的異常。三、檢測原理：通過分析紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD55和CD59的表達(dá)，流式細(xì)胞儀可以將被分析細(xì)胞分為III型細(xì)胞（正 常表達(dá)CD55和CD59）、II型細(xì)胞（部分表達(dá)CD55和CD59,即CD55和CD59表達(dá)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度降低1/2） 和I型細(xì)胞（細(xì)胞的CD55和CD59平均熒光強(qiáng)度更低1/2），還能夠分別計算出紅細(xì)胞和白細(xì)胞中這3群細(xì)胞的百分比。由于CD59 和 CD55檢測粒細(xì)胞的陰陽性區(qū)分度不是很好，而且不

31、同樣本間變異很大，最新的PNH指南推薦使用FLAER。嗜水氣單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的毒素aerolysin可通過與GPI蛋白連接在細(xì)胞膜上形成通道 而導(dǎo)致正常細(xì)胞溶解，PNH細(xì)胞由于缺乏GPI蛋白使其具有抵抗毒素作用而最終保持細(xì)胞完好。利用這一原理 將aerolysin變異體(Flaer) 標(biāo)記熒光，聯(lián)合CD59檢測PNH克隆。這將為檢測白細(xì)胞 PNH 克隆提供有效工具，結(jié)合其他GPI蛋白，如CD14、CD157再搭配設(shè)門抗體提高準(zhǔn)確性。除了常規(guī)檢測，PNH高靈敏度分析不用于PNH的分型，而是用于檢測骨髓功能衰竭患者是否伴有少量PNH克隆細(xì)胞。四、實驗：1. 試劑方案2. 樣本紅細(xì)胞標(biāo)記：1）全血稀

32、釋200倍（也可以10µL血稀釋到1mL PBS）；2） 樣品管： 20ul稀釋血+20µLCD55CD59單抗對照管： 20ul稀釋血+20µLIgG同型對照；3） 混勻，室溫孵育15分鐘；4） 加PBS 2-3 mL，上機(jī)分析。12分析類型目標(biāo)細(xì)胞設(shè)門方案試劑方案常規(guī)檢測（1% 以上克隆含量, 目標(biāo)細(xì)胞群至少收集 5000 個）紅細(xì)胞FS/SS(LOG) 或 CD235aCD59(55)中性粒細(xì)胞CD45/SS 或 CD15/SSFLAER，CD24，CD66b，CD16；建議選擇 2 種試劑。不推薦使用CD55/CD59 組合單核細(xì)胞CD45/SS 或 CD

33、33/SS CD64/SS 或 CD163/SSFLAER，CD14，CD48，CD55， CD157高靈敏度檢測（0.01% 甚至以下的克隆含量，目標(biāo)細(xì)胞群至少收集 25,000 個）紅細(xì)胞CD235a/SSCD59+/-CD55 可以用相同或不同熒光素中性粒細(xì)胞CD15/SSCFLAER，CD24，CD66b，CD16；必須使用至少兩種試劑。不推薦使用CD55/CD59 組合單核細(xì)胞不適合檢測高靈敏度分析5粒細(xì)胞標(biāo)記：1）取全血， OptiLyse C溶血10min；2） 溶血后離心洗滌，1500轉(zhuǎn)5分鐘；3） 取細(xì)胞1x106，按照說明書，同單抗孵育20min；4） 加1mL PBS直接上機(jī)檢測。3. 上機(jī)檢測開啟DxFLEX流式細(xì)胞儀，打開CytExpert，分別調(diào)取已建立PNH紅細(xì)胞檢測方案和PNH白細(xì)胞檢 結(jié)果。測方案，添加新試管，開始獲取，根據(jù)實際圖形適當(dāng)調(diào)節(jié)門的位置，4. 結(jié)果演示正常：RBC正常：WBC異常：RBC異常：WBC13五、報告單內(nèi)容：（1） GPI相關(guān)蛋白表達(dá)正常粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和紅細(xì)胞顯示：GPI相關(guān)抗原表達(dá)正常， PNH克隆細(xì)胞未檢測到。（2） GPI相關(guān)蛋白表達(dá)異常1） 檢測出PNH克隆細(xì)胞；2） 白細(xì)胞PNH克隆大小 ，例：粒細(xì)胞為：88.9% ；單核細(xì)胞為90.1%；3） 紅細(xì)胞PNH克隆細(xì)胞情況 例：Type I (47.3%)，