1、    脂多糖對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響及意義        摘要目的：探討脂多糖(LPS)對血管內皮細胞(VEC)損傷的機制以及在急性肺損傷（ALI）發病中的作用。方法：通過建立人臍靜脈內皮細胞體外培養，采用流式細胞技術觀察LPS對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)凋亡的影響。結果：LPS加入細胞培養中，可明顯誘導HUVEC凋亡，并隨著作用時間的延長和LPS濃度增加，細胞凋亡率也相應增加，一定范圍內呈時間、劑量、效應關系。結論：細胞凋亡是血管內皮細胞受損的主要方式之一。主題詞

2、脂多糖類；內皮，血管；細胞；肺中分類號R329.2+4文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)02-0128-03 Effect of lipopolysaccharide on apoptosis of human umbilical vein endothelial cellsSONG Yong(Department of Respiratory Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Command, Nanjing 210002)MAO Bao-ling, WANG Jian-chun(Institute of Respir

3、atory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)Abstract AIM: To explore the mechanism of lipopolysaccharide (LPS) on vascular endothelial cell（VEC） damage. METHODS: By using cytometry techniques, we studied the effects of LPS on apoptosis of human umbilica

4、l vein endothelial cells (HUVECs） in vitro. RESULTS: LPS was able to induce apoptosis of HUVECs in a time-dose-dependent fashion.CONCLUSION:Apoptosis might play a role in LPS-induced damage of vascular endothelial cells. MeSHLipopolysaccharides; Endothelium, vascular; Cells; Lung血管內皮細胞（vascular endo

5、thelial cell, VEC）是機體一類重要的細胞群體，在血管通透性屏障、免疫防御及炎癥反應中起著極其重要的作用1，2。研究表明，VEC結構和功能破壞，是ARDS的重要發病機制之一3。本實驗通過建立人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）體外培養，觀察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對HUVEC凋亡的影響；探討致病因素對VEC損傷的機制以及在急性肺損傷（acute lung injury, ALI）發病中的作用。材料和方法一、實驗材料細胞來源人新鮮臍帶由新橋醫院婦產科提供，大腸桿菌（O111：B4）

6、脂多糖（LPS），美國Sigma公司。兔抗人因子相關抗原抗體（CH18-0018），美國Zymed公司。二、人臍靜脈內皮細胞體外培養的建立參照文獻進行4；人臍靜脈內皮細胞的鑒定，采用免疫組織化學SP法。三、HUVEC凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳按B.M公司試劑盒(Apoptotic DNA Ladder Kit）提供方法進行。四、HUVEC凋亡流式細胞檢測5將胃蛋白酶液1 mL加入有被消化細胞的塑料試管中，室溫，消化23 min，消化期間輕輕吹打細胞使其進一步離散、然后終止消化，收集細胞懸液，以銅網（200目）過濾，除去細胞團塊，以低速離心除去細胞碎片。細胞用PBS洗12次，按1×10

7、6細胞/mL加入溴化乙錠（EB）染液，4，30min。上機（FACS 420型美國）檢測，每個樣品計數10 000個細胞，采用計算機系統進行分析。五、實驗設計分組(一)實驗時使用的細胞為培養的原代細胞。每個樣品的細胞數為1×106 。(二)待培養皿細胞80%融合，實驗時培養液改為無血清培養液，同時加入LPS刺激，LPS作用時間為24 h。(三)LPS處理組：分為：1 g/mL、10 g/mL、100 g/mL 3組。對照組：采用等量無菌生理鹽水加入培養基中作為對照。六、統計分析全部數據都以均數±標準差（±s）表示，采用直線相關分析和t檢驗。結果一、人臍靜脈內皮細胞

8、體外培養的建立采用胰蛋白酶消化法建立HUVEC體外培養，細胞于塑料培養皿中生長較快，一般過夜后大部分細胞即貼壁并生長，開始細胞呈梭形，連接呈片后顯現內皮細胞形狀，呈鋪路石樣，臺盼藍染色細胞活性在95%以上，經因子相關抗原免疫組化鑒定陽性；細胞純度在90%以上，符合本實驗要求。二、培養時間對脂多糖誘導的HUVEC凋亡的影響由表1可以看出，LPS 10 g/mL作用HUVEC，隨著培養時間的延長，細胞凋亡率不斷升高，細胞凋亡率與培養時間呈正相關（r=0.938，P0.01）。三、LPS和TNF誘導HUVEC凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳LPS 10 g/mL加入HUVEC培養24 h，DNA電泳均可見

9、典型的“梯狀”帶，而對照組無上述類似變化(1)。四、LPS誘導HUVEC凋亡結果表明，隨LPS濃度的增加，HUVEC的凋亡率也明顯增加，與對照組相比差異非常顯著（P0.01）。表1培養時間對HUVEC凋亡的影響Tab 1Effect of culture time on LPS-induced HUVEC apoptosis in vitro (±s, n=4)Culture time（h）Ratio of apoptosis（%）43.3±0.386.7±0.61213.8±1.12424.8±2.53626.5±2.7Fig 1

10、Electrophoresis of DNA in HUVEC by LPSA:LPS 10 g/mL；B：DNA/EcoR +Hind Marker1HUVEC凋亡的DNA電泳A：LPS 10g/mL； B：DNA/EcoR +Hind 分子量標準表2LPS對HUVEC凋亡的影響Tab 2Effect of LPS on HUVEC apoptosis in vitro (±s，n=4)GroupLPS（g/mL）Ratio of apoptosis（%）LPS16.4±1.11024.8±2.510036.7±3.9Control2.1±0

11、.4P0.01,vs control group 討論血管內皮細胞襯覆于血管內壁，構成血管通透性的主要屏障。能合成和分泌調節凝血-纖溶系統的物質、調節血管張力的因子以及細胞因子等在血管形成、創傷愈合及炎癥反應中起重要作用6。目前，VEC受損已被視為創傷、休克、感染、心血管疾病、腫瘤和急性肺損傷等多種疾病和綜合征發生、發展的病理基礎7。本研究通過建立HUVEC體外培養模型，以LPS刺激，觀察其致損傷效應。結果發現，LPS加入細胞培養中，可明顯誘導HUVEC凋亡，并隨著作用時間的延長和LPS濃度增加，細胞凋亡率也相應增加，一定范圍內呈時間、劑量、效應關系。結果提示，在ALI病程中，肺血管內皮細胞的

12、受損，可能部分是以細胞凋亡的方式進行的。由于血管內皮細胞不屬于快速自我更新的細胞群體，因此，VEC凋亡后降低了內皮細胞儲備8，致使血管內皮裂隙增大，通透性增加，導致通透性肺水腫、發生急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。LPS誘導VEC凋亡的確切機制至今仍不清楚，分析LPS致VEC凋亡的機制可能與其激活特定的細胞凋亡信號通路有關。研究表明，LPS可激活ICE樣蛋白酶-caspase-3，而致VEC凋亡，而caspase-3的特異性抑制劑：Ac-DEVD-CHO可阻斷由LPS介導的VEC凋亡。一些研究還表明，LPS誘導VEC凋亡，氧自由基起重要作用9。Tseng等10構建了含人iNOS cDNA的腺病

13、毒載體，轉染動物血管內皮細胞后，結果表明，基因轉染后可明顯增加VEC的一氧化氮（NO）的合成，并抑制LPS介導的VEC凋亡，說明NO也具有保護血管內皮細胞的功能，提示吸入NO治療ARDS的療效可能部分與這種功能的發揮有關。盡管單一細胞類型體外培養不能反應ALI時體內微血管損傷的復雜過程，但可以從一個側面來認識VEC受損的細胞機制和基因調控；在一定程度上可模仿ALI的臨床狀態。明確ALI時肺微血管內皮細胞損傷的分子機制，阻斷某些基因表達和信號傳導可能有效的預防、治療ALI，降低其病死率。基金項目國家自然科學基金資助(39700056)宋勇（南京軍區南京總醫院呼吸內科，江蘇 南京 210002）毛

14、寶齡（第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸病研究所，重慶 400037）王建春（第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸病研究所，重慶 400037）參考文獻1Buchman TG, Abello PA, Smith EH, et al. Induction of heat shock response leads to apoptosis in endothelial cells previously exposed to endotoxin J. Am J Physiol,1993,265:H165H170.2Jaffe EA. Physiologic function of the normal endot

15、helial cell. In:Loscalzo J, Creagher M, Dzau VJ. eds. Vascular Medicine M. 1st ed. Boston:Little Brown,1992,346.3Martin MA, Silverman HJ. Gram-negative sepsis and the adult respiratory distress syndrome J. Clin Infect Dis,1992,14:13131328. 4安靜，黎鰲，楊宗城，等.胎兒臍靜脈內皮細胞的培養 J.第三軍醫大學學報，1990，12：222224.5左連富，主編.

16、流式細胞術與生物醫學.第1版.遼寧科學技術出版社,1996.371374.6Vane JR, Anggard EE, Botting RM. Regulatory functions of the vascular endothelium J. N Engl J Med,1990,323:2736.7Sessler CN, Bloomfield GL, Fowler AA. Current concepts of sepsis and acute lung injury J. Clin Chest Med,1996,17:213235. 8Eissner G, Kohlhuber F, Grell M, et al. Critical involvement of transmembrane tumor necrosis factor- in endothelial programmed cell death mediated by ionizing radiation and bacterial endotoxin J. Blood,1995,85:41844193. 9Nicholson DW, Ali A, Thoronberry NA, et al. Identification and inhibition of the