1、生物胺的檢測(cè)方法評(píng)價(jià)導(dǎo)讀 生物胺是一類含氮低分子化合物，對(duì)動(dòng)植物和微生物有重要的生理作用。適量的生物胺有助于人體正常的生理功能，過(guò)量則會(huì)引起不良的生理反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外食品中的生物胺的檢測(cè)主要采用液相色譜,一般僅是組胺檢測(cè)。實(shí)際上許多食品中還含有其它的生物胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、尸胺、苯乙胺、章魚胺)，且其存在會(huì)對(duì)組胺的毒性有協(xié)同作用。因此，多組分生物胺的同時(shí)檢測(cè)對(duì)于食品的安全和水產(chǎn)品出口有著重要的意義。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外比較常見的生物胺檢測(cè)方法作了敘述和比較。Appraisal of Biogenic Amines Determination Liu Chen-qi

2、Ding Zhuo-ping* Wang Xi-chang (College of Food Science and Technology, Shanghai Fisheries University 200090) Abstract: Biogenic amines are aliphatic, alicyclic or heterocyclic organic bases of low molecular mass, which arise as a consequence of metabolic processes in animal, plan

3、ts and microorganisms. They can also cause unnatural or toxic effects when they are consumed in large amounts. A high performance liquid chromatographic method is described as the main method of determining biogenic amines in food, especially histamine. There are also many biogenic amines

4、to be determined, such as: tryptamine, octopamine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine, tyramine, spermidine, and spermine. So it is meaningful and worthwhile for aquatic products export and food safety that different kinds of biogenic amines can be determined together. In this article, the dif

5、ferent determination methods of biogenic amines are introduced and compared . Key words: biogenic amines; determination of biogenic amines; food safety 1 引言 生物胺是一類含氮的低分子量有機(jī)化合物的總稱。根據(jù)結(jié)構(gòu)可以把生物胺分成3類:脂肪族:腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等;芳香族:酪胺、苯乙胺等;雜環(huán)族:組胺、色胺等。1.1 生理作用 各種動(dòng)植物的組織中都含有少量的生物胺，也普遍存在于多種食品和酒、飲料中。

6、生物胺不僅是生成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)的前體，也是生成致癌物質(zhì)的前體。少量的生物胺對(duì)人體有益，如兒茶胺、和組胺等能調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)，控制血壓;苯乙胺和酪胺有升壓作用。過(guò)量攝入則會(huì)引起中毒。1.2 生物胺引起的食品安全和水產(chǎn)品出口問(wèn)題 生物胺中組胺對(duì)人類的健康的影響最大，其次是酪胺。攝入840mg組胺產(chǎn)生輕微中毒癥狀，超過(guò)40mg產(chǎn)生中等中毒癥狀，超過(guò)100mg產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀。酪胺超過(guò)lOOmg會(huì)引起偏頭痛。當(dāng)食品中生物胺含量達(dá)到1000mgkg-1時(shí)會(huì)對(duì)人體健康造成極大的危害。除了組胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在會(huì)增強(qiáng)組胺和酪胺的不良作用。因此，很難確定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量生物胺的毒性

7、。美國(guó)FDA通過(guò)對(duì)爆發(fā)組胺中毒的大量數(shù)據(jù)的研究，確定食品中組胺的危害作用水平為:500mgkg-1;歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過(guò)100 mgkg-1，其他食品中組胺不得超過(guò)100mgkg-1，酪胺不得超過(guò)100800mgkg-1;我國(guó)規(guī)定鮐魚中組胺不得超過(guò)1000mgkg-1，其他海水魚不得超過(guò)300 mgkg-11。我國(guó)水產(chǎn)品出口企業(yè)如沒(méi)有重視生物胺的檢測(cè)，出口產(chǎn)品易遭罰沒(méi)，而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 2 生物胺檢測(cè)方法 胺的分析方法包括HPLC、TLC和酶聯(lián)免疫分析等。組胺等生物胺含有-NH2能形成氫鍵，所以常用的方法是HPLC-FLD、HPLC-UV。國(guó)內(nèi)沒(méi)有同時(shí)測(cè)

8、定多種生物胺(8種以上)的檢測(cè)方法。 2.1 國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)有關(guān)生物胺的測(cè)定方法 2 采用高效液相色譜法，以1，6-己二胺為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定柿子中的精胺、亞精胺、尸胺和腐胺。樣品經(jīng)丹磺酰氯衍生，硅膠柱凈化，Lichrosorb NH2柱(5µm，200mm×4.0mm)分離后，以氯仿:乙酸乙酯:三乙胺(98.4:1.5:0.1)為流動(dòng)相，流速為1.5mLmin-1，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為336nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495nm，精胺、亞精胺、尸胺和腐胺的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，其回收率分別為98.99%、94.02%、96.46%和105.44%。生物胺定量檢測(cè)限1

9、5mgkg-1 2.2 國(guó)外文獻(xiàn)有關(guān)生物胺的測(cè)定方法 2.2.1 7-氟-4-硝基苯并二唑柱前衍生/毛細(xì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物胺3 用7-氟-4-硝基苯并二唑(NBD)柱前衍生/毛細(xì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物胺。生物胺包括色胺、組胺和胍丁胺，進(jìn)行衍生反應(yīng)后，在毛細(xì)柱(20m*0.25mm C8 5m)上分離，選擇電噴霧離子化，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)得到特征的子離子。胍丁胺是一種潛在的神經(jīng)遞質(zhì)。胍丁胺的檢測(cè)限為0.6ngml-1 (信噪比=3)，在15-1000ngml-1濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。此方法優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確地定性定量，但對(duì)儀器要求較高

10、，經(jīng)濟(jì)性和普及性都不好,測(cè)定的胺種類較少。 2.2.2 丹酰氯(Dansyl chloride)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定生物胺4 5 HPLC檢測(cè)香腸中的色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，組胺，5-羥基色胺，酪胺，亞精胺和精胺。用高氯酸處理、丹酰氯衍生后，用氨水去除尸胺附近的干擾峰。C18反相色譜柱梯度分離，流動(dòng)相為乙腈:甲醇:水:乙酸=43:30:26:1。紫外檢測(cè)器(=254nm)，流速為1.0mLmin-1 ，該方法對(duì)于單個(gè)胺的檢測(cè)限是1-5mgkg-1。線性相關(guān)系數(shù)都要大于0.9999。丹酰氯衍生法是一種簡(jiǎn)單，可靠，實(shí)用的方法，選用微波反應(yīng)系統(tǒng)能大量縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，衍生產(chǎn)物

11、穩(wěn)定。 2.2.3 苯甲酰氯(benzoyl chloride)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定生物胺6 7 以苯甲酰氯為柱前衍生劑，用HPLC檢測(cè)生物胺是一種快速,靈敏的方法。最佳衍生條件:30，40min;線性范圍在0.02-4g之間。用6%的三氯乙酸處理。梯度洗脫(在4min內(nèi)，甲醇:水=55:45到80:20)，C18柱分離,紫外檢測(cè)器檢測(cè)(254nm)，流速為1.0mLmin-1。該方法的主要特點(diǎn)與丹酰氯衍生法類似，產(chǎn)物穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便。但衍生時(shí)間長(zhǎng)，樣品中其它雜質(zhì)能與苯甲酰氯反應(yīng)形成干擾峰。在前處理中使用固相萃取，以及調(diào)節(jié)好流動(dòng)相極性對(duì)于分離雜質(zhì)峰與生物胺是非常關(guān)鍵的。

12、 2.2.4 鄰苯二醛(o-phthalaldehyde) 柱后衍生高效液相色譜法測(cè)定生物胺8 9 鄰苯二醛(OPA)作為一種常用的柱后衍生劑，其特點(diǎn)衍生反應(yīng)快，但產(chǎn)物不穩(wěn)定易分解，先通過(guò)乙酸乙酯把生物胺從樣品中萃取出來(lái)，C18反相色譜柱分離，梯度洗脫(在15min內(nèi)，0.08molL-1醋酸:甲醇:乙酸胺=52:45:3到0:100:0)，OPA柱后衍生，熒光檢測(cè)器(入射波長(zhǎng)=340nm，發(fā)射波長(zhǎng)=440nm)進(jìn)行檢測(cè)。其檢測(cè)限在100300gL-1之間，線性范圍為0.515mgL-1，柱溫:40。流速為1.0mLmin-1。此方法特點(diǎn)是快速、靈敏、產(chǎn)物不穩(wěn)定易分解，柱后

13、衍生還需要添置柱后衍生裝置，在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下可選用這種方法。 2.2.5 熒光胺(fluorescamine)柱后衍生高效液相色譜法測(cè)定生物胺8 根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，熒光胺曾用來(lái)檢測(cè)酒中的生物胺。取樣加pH=8.0的硼酸緩沖溶液，充分混勻，C18反相色譜柱分離，梯度洗脫(在20min內(nèi)，0.08 molL-1醋酸:甲醇:乙酸胺=48:46:6到0:100:0),熒光胺(濃度為0.5mgmL-1)柱后衍生，用熒光檢測(cè)器檢測(cè)(入射波長(zhǎng)=395nm，發(fā)射波長(zhǎng)=460nm)。流速為1.0mLmin-1。該方法分離檢測(cè)8種單氨基胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品耗時(shí)不過(guò)30min。但在衍生過(guò)程中雙

14、氨基或多氨基的生物胺會(huì)產(chǎn)生多個(gè)吸收峰，對(duì)分離產(chǎn)生影響，因此檢測(cè)的胺種類少，有一定局限性。熒光胺法的特點(diǎn)是快速、靈敏，與鄰苯二醛法類似，但產(chǎn)物不穩(wěn)定，需添置額外柱后衍生裝置。 3 結(jié)論 國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法都以HPLC，衍生劑以丹酰氯和苯甲酰氯等柱前衍生劑居多，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定，能同時(shí)處理大量樣品，用 HPLC紫外檢測(cè)器，是值得推廣的檢測(cè)方法。 熒光胺和OPA作為柱后衍生劑，特點(diǎn)是快速、靈敏度更高，但產(chǎn)物不穩(wěn)定，分解快，需要使用柱后衍生裝置和熒光檢測(cè)器，根據(jù)報(bào)道熒光胺多用在測(cè)定酒類中的生物胺，分離測(cè)定食品種類有限。 7-氟-4-硝基苯并二唑(NBD

15、)柱前衍生/毛細(xì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物胺也是一種可靠、靈敏的方法，但要使用到LC-MS/MS，作為一種日常的檢測(cè)的方法不大合適。 綜上所述，就方法的可靠性，成熟性，可操作性而言，選用柱前衍生劑丹酰氯或苯甲酰氯、HPLC-UV法測(cè)定多種生物胺是比較合適的。 參閱文獻(xiàn): 1李志軍 生物胺與食品安全J食品與發(fā)酵工業(yè),2004,7 2吳莜丹等. 理化檢驗(yàn)B化學(xué)分冊(cè), 2004,40(2):72 3Yaru Song, Zhe Quan, Joseph L.Evans et al. J. Enhancing capillary liquid chr

16、omatography/tandem mass spectrometry of biogenic amines by pre-column derivatization with 7-fuloro-4-nitrobenzoxadiazole.Rapid Commun, Mass Spectrum 2004, 18,989-994 4 Julia Y.Hui & Steve L.Taylor .J. High pressure liquid chromatographic determination of putrefactive amines in foods . Analy

17、sis Chemistry. 1983,vol 66,No.4 P853-P857 5 Rosa M. Linares, Juan H. Ayala, Ana M. Afonso and Venerando González DíazJ Rapid microwave-assiste dansylation of biogenic amines: Analysis by high-performance liquid chromatography ,Journal of Chromatography A. 1998,808,87-93 6 Gow-Chi

18、n Yen and Chiu-Luan Hsien , J.Simultaneous analysis of biogenic amines in canned fish by HPLC .Journal of Food Science,1991,Volume 56, No1，158-160 7 Deng-Fwu Hwang,Sheng-Hsiung Chang, Chyuan-Yuan Shiua et al.J.High-performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning. Journal of Chromatography B (1997)693, 23-30 8 Carole Buteau and Cyriel Louis Duitschaever, J.High-performance liquid chromatographic detection and quantitation of amin