1、第十三章第十三章 程序性細胞死亡與細胞衰老程序性細胞死亡與細胞衰老 程序性細胞死亡程序性細胞死亡 細胞衰老細胞衰老 (cellular aging或或cell senescence) 第一節第一節 程序性細胞死亡程序性細胞死亡動物細胞的程序性死亡動物細胞的程序性死亡植物細胞與酵母細胞的程序性死亡 細胞凋亡的細胞凋亡的概念：概念： 細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結束生命的過程，也常常被稱為細胞程序死亡（programmed cell death， PCD）。凋亡細胞將被吞噬細胞吞噬。 細胞調亡的細胞調亡的生理意義：生理意義： 它是維持組織機能和形態所必需的。生物發育過程中及成體組織中正常的

2、細胞凋亡有助于保證細胞只在需要它們的時候和需要它們活的地方存活。這對于多細胞生物個體發育的正常進行，自穩平衡的保持以及抵御外界各種因素 的干擾方面都起著非常關鍵的作用。 蝌蚪尾的消失蝌蚪尾的消失 發育過程中手和足發育過程中手和足的成形過程的成形過程 脊椎動物的神經系統的發育脊椎動物的神經系統的發育 脊椎動物的神經脊椎動物的神經系統的發育系統的發育 細胞死亡的方式通常有3種：即細胞壞死（necrosis）。細胞凋亡（apoptosis）。細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。l是細胞受到化學因素（如強酸、強堿、有毒物質）、物理因素（如熱、輻射）和生物因素（如病原體

3、）等環境因素的傷害，引起細胞死亡的現象。l早期表現為胞質內線粒體和內質網腫脹、崩解，核發生固縮或斷裂。隨著胞質內蛋白變性、凝固或碎裂，以及嗜堿性核蛋白的降解，細胞質呈現強嗜酸性，故壞死組織或細胞在蘇木精/伊紅染色切片中，胞質呈均一的深伊紅色，原有的微細結構消失。l在含水量高的細胞，可因胞質內水泡不斷增大，并發生溶解，導致細胞結構完全消失，最后細胞膜和細胞器破裂，DNA降解，細胞內容物流出，引起周圍組織炎癥反應。lKerr（ 1972）最先提出，與細胞壞死的區別是：染色質聚集、分塊、位于核膜上，胞質凝縮，最后核斷裂，細胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體凋亡小體（apoptotic bodies）；

4、凋亡小體內有結構完整的細胞器，還有凝縮的染色體，可被鄰近細胞吞噬消化，因始終有膜封閉，沒有內溶物釋放，故不會引起炎癥；凋亡細胞中仍需要合成一些蛋白質，但是在壞死細胞中ATP和蛋白質合成受阻或終止；核酸內切酶活化，導致染色質 DNA 在核小體連接部位斷裂，形成約 200bp 整數倍的核酸片段，凝膠電泳圖譜呈梯狀；凋亡通常是生理性變化，而細胞壞死是病理性變化。起因 生理或病理性 病理性變化或劇烈損傷范圍 單個散在細胞 大片組織或成群細胞細胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小體 破損染色質 凝聚在核膜下呈半月狀 呈絮狀細胞器 無明顯變化 腫脹、內質網崩解細胞體積 固縮變小 腫脹變大凋亡小體 有，被鄰近細

5、胞或 無，細胞自溶，殘余碎片 巨噬細胞吞噬 被巨噬細胞吞噬基因組DNA 有控降解，電泳圖譜呈梯狀 隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質合成 有 無調節過程 受基因調控 被動進行炎癥反應 無，不釋放細胞內容物 有，釋放內容物。細胞壞死與凋亡的細胞壞死與凋亡的形態區別形態區別壞死細胞壞死細胞凋亡細胞凋亡細胞 Morphologi changes: Early : Chromosome condensation, cell body shrink Later : Blebbing and Nucleus and cytoplasm fragmentApoptotic bodies At last: Ph

6、agocytosed彎曲正常正常凋亡凋亡正常正常凋亡凋亡核酸內切酶活化，導致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成約200bp整數倍的核酸片段，凝膠電泳圖譜呈梯狀細胞色素 c 誘導的凋亡細胞 DNA電泳圖0h1h3h 4hCKM2h物理性因子：物理性因子： 包括射線（紫外線， 射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等。化學及生物因子：化學及生物因子： 包括活性氧基團和分子，DNA 和蛋白質合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子 （TNF），抗 Fas/Apo-1/CD95抗體等。形態學觀測：形態學觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察。DNA電泳：電泳：DNA片段呈現出梯狀條帶。TUNE

7、L測定法：測定法：即DNA斷裂的原位末端標記法。 TUNEL是指末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法。此法 可對凋亡細胞的核DNA中產生的3-OH斷裂缺口進行原位標記。彗星電泳法彗星電泳法（comet assay）：又叫單細胞電泳技術和微凝膠電泳。 用以檢測單個細胞中的DNA斷裂。細胞凋亡中 DNA ladder 的出現被認為是細胞群發生凋亡的主要標志。細胞在凋亡過程中會有不同的DNA片段化程度，在電場中泳動速度較快，呈現出一種彗星式的圖案。正常的無DNA斷裂，在電場中泳動速度較慢，呈圓球形。流式細胞分析：流式細胞分析：細胞凋亡中 DNA斷裂，用碘化丙錠使DNA產生激發熒光。I

8、BRVSBV 在細胞凋亡一詞出現之前，胚胎學家已觀察到動物發育過程中存在著細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）現象，它是胚胎正常發育所必需的。近年來PCD和細胞凋亡常被做為同義詞使用，但兩者實質上是有差異的。 -首先，PCD是一個功能性概念，描述在一個多細胞生物體中，某些細胞的死亡是個體發育中一個預定的，并受到嚴格控制的正常組成部分，而凋亡是一個形態學概念，指與細胞壞死不同的受到基因控制的細胞死亡形式； -其次，PCD的最終結果是細胞凋亡，但細胞凋亡并非都是程序化的。2002年10月7日英國人悉尼布雷諾爾、美國人羅伯特霍維茨和英國人約翰蘇爾斯頓，因在細胞程序性死

9、亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫學獎。Sydney BrennerH. Robert HorvitzJohn E. Sulston 細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現象，是維持體內細胞數量動態平衡的基本措施。在胚胎發育階段通過細胞凋亡清除多余的和已完成使命的細胞，保證了胚胎的正常發育；在成年階段通過細胞凋亡清除衰老和病變的細胞，保證了機體的健康。和細胞增殖一樣細胞凋亡也是受基因調控的精確過程。 細胞凋亡的途徑主要有兩條：一條是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase。一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。1、

10、Caspase家族家族 Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，相當于線蟲中的ced-3，這些蛋白酶是引起細胞凋亡的關鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細胞內的蛋白質降解，使細胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點： 酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性； 裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，所以命名為caspase（ Cysteine aspartic acic specific protease ），方便起見稱之為凋亡酶； 都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產生兩個活性亞基。最早發現人類中與線蟲ced-3同源的基因是 ICE (Interleukin-1-conv

11、erting enzyme) ，即：白介素-1 轉換酶基因，因該酶能將白介素前體切割為活性分子，故名。在人類細胞中已發現11個 ICE 同源物，分為2個亞族：-ICE 亞族：參與炎癥反應-CED-3 家族，參與細胞凋亡，又分為兩類： 啟動者啟動者（initiator）：如 caspase-8、9，受到信號后，能通過自剪接而 激活，然后引起 caspase 級聯反應，如 caspase-8 可依次激活 caspase-3、 6、7。 執行者執行者（executioner或effector）：如caspase-3、6、7，它們可直接降解胞 內的結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化或自剪接

12、的方 式激活；細胞中還具有 caspase 的抑制因子，稱為 IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），屬于一個龐大的蛋白家族。它們能通過 BIR 結構域（baculovirus IAP repeats domain）與 caspase 結合，抑制其活性，如XIAP。ICE家族成員 A：3類caspase：藍色參與炎癥反應，紅色為執行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結構模型；C：caspase-3的活化過程執行者啟動者參與炎癥反應名稱及其別名 底物 caspase-1（ICE） Pro-IL ； pro-caspase 3，7 caspase-2（

13、Nedd-2/ICH1） caspase-3（apopain/CPP32/Yama） PARP ； SREBP ； DFF ； DNA-PK caspase-4（Tx/ICH2/ICE rel-II） caspase-5（ICE rel-III/TY） caspase-6（Mch2） Lamin A ； keratin 18 caspase-7（ICE-LAP3/Mch3/CMH-1） PARP ； pro-caspase 6 ； DFF caspase-8（FLICE/MACH/Mch5） caspase-9（ICE-LAP6/Mch6） caspase-10（Mch4/FLICE2） PA

14、RP caspase-11（ICH3） caspase 超家族成員及其相應底物超家族成員及其相應底物 Caspase 自身以非活化的 Procaspase存在，其激活依賴于其他的 Caspase 在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化。l Caspase-8自剪切活化，激活 Caspase-3，Caspase-7成為凋亡的執行者。l Caspase-3 激活 Caspase-6。l Caspase 可降解結構蛋白、信號蛋白、轉錄調控蛋白、周期蛋白等等。l Caspase 還可降解CAD的調節蛋白，釋放出CAD，CAD進入細胞核降 解 DNA。CAD 為caspase-activated Dnas

15、e（脫氧核苷酸酶），存在于胞質中。l線蟲(C.elegans)凋亡研究發現ced3，ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE，即Caspase1。lICE蛋白酶參與 Fas 誘導的細胞凋亡，與線蟲細胞凋亡基因 ced-3 同源。lced-4 在哺乳動物中的同源體為同源體為Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)，能激活Caspase3 ，這一過程需要細胞色素細胞色素c（Apaf-2）和Apaf-3的參與。CD95 fas 又稱作 APO-1，屬 TNF 受體和 NGF 受

16、體家族。 1993 年人白細胞分型國際會議統一命名為統一命名為 CD95。 fas 基因編碼產物為分子量 45KD 的跨膜蛋白。 Fas 蛋白與 Fas 配體組成 Fas 系統，二者的結合導致 靶細胞走向凋亡。lFas 具有三個富含半胱氨酸的胞外區和一個稱為死亡結構域（Death domain，DD）的胞內區。lFas 的配體 FasL（Fas ligand）與 Fas 結合后，Fas 三聚化使胞內的DD區構象改變，然后與接頭蛋白FADD（Fas-associated death domain）的DD區結合，而后 FADD 的 N 端 DED區（death effector domain）就能

17、與Caspase-8（或-10）前體蛋白結合，形成DISC (death-inducing signaling complex )，引起caspase-8、10通過自身剪激活，它們啟動 caspase 的級聯反應，使caspase-3、-6、-7激活，這幾種Caspase可降解胞內結構蛋白和功能蛋白，最終導致細胞凋亡。=TNF(1) Extrinsic pathway: Fas Signaling PathwayFas (also called Apo-1 or CD95) is a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) sup

18、erfamily. Receptor-mediated pathway of apoptosisBcl-2 Family(cytoplasmic factors): Bad，Bid，and bax： promote apoptosis; Bcl-X， Bcl-w，and Bcl-2: prevent apoptosis.Internal stimuli： DNA damage， high Ca2+ , Oxidative stressv線粒體在 CD95 誘導的凋亡中的作用：lCaspase 引起線粒體 PT（Permeability transition）孔打開，導致線粒體的跨膜電位下降；l

19、細胞色素 C 被釋放到胞質中、激活 Caspase-9，后者再激活 Caspase-3。lBcl-2，Bcl-xl 均作用于線粒體。細胞色素釋放引起的凋亡 當細胞接受凋亡信號分子（Fas，TNF等）后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內的銜接蛋白(Adaptor protein)結合，這些銜接蛋白又募集 Procaspases 聚集在受體部， Procaspase 相互活化并產生級聯反應，使細胞凋亡。 下游 Caspases 活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；裂解 Dnase （脫氧核苷酸酶）結合蛋白，使 Dnase 釋放，降解 DNA 形成DNA Ladde

20、r；裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬；導致膜脂 PS 重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。Procaspases are activated by binding to adaptor proteinsThe caspase cascade involved in apoptosisA.Procaspase activation by proteolytic cleavage.B.Caspase cascade(2) Intrinsic pathway: Mitochondrial pathwayThe mitochondria-mediated pathw

21、ay of apoptosisVarious types ofcellular stressBcl-2 family: Bad or Bax to become inserted into OM of MitRelease of cytochrome c from I-O space of Mit.Form a multisubunit complex; and Caspase Cascade,Bcl-2是一種原癌基因，是 ced-9 在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡；與線粒體及內質網膜相結合；Bcl-2名稱來源于B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2

22、，bcl-2)。 bcl-2 蛋白，是膜的整合蛋白，主要存在于線粒體外膜、核膜及部分內質網中。 Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結構域（BH1-4），并且通常羧基末端有一穿膜的結構域 (transmembrane region，TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結構域，BH3是與促進凋亡有關的結構域。根據功能和結構可將Bcl-2基因家族分為兩類： -抗凋亡的抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1； -促進凋亡的促進凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含

23、BH3結構，如Bid、Bad。基因產物 功 能 BCL-2 凋亡抑制劑，可和Bax及Bak結合 BCL-x 其L型抑制凋亡，S型促進凋亡，與Bax及Bak結合 BCL-w 凋亡抑制劑 Bax 凋亡促進劑，可與BCL-2，BCL-XL，EIB19K結合 Bak 凋亡促進劑，亦可作抑制劑，可與BCL-2，BCL-X和E1B19K結合 MCL-1 凋亡抑制劑 Bad 凋亡促進劑，與BCL-2和BCL-XL結合 Ced-9 線蟲中的凋亡抑制劑，BCL-2同源物 E1B19K 腺病毒凋亡抑制劑，與Bax和Bak結合 Bcl-2家族 引自Katja C. Zimmermann等2001當 Caspase8

24、 活化后，它一方面作用 Procaspase3，另一方面使Bid 裂解成 2 個片段，其中含 BH3 結構域的 C-端片段被運送到線粒體，與 Bcl-2/Bax 的 BH3 結構域形成復合物，導致細胞色素 C 釋放。Cytc 與胞質中Ced4 同源物 Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor）結合并活Apaf-1，活化的 Apaf-1 再活化 Procaspase9，最后引起細胞凋亡。 Molecular pathways of apoptosisTwo principle pathways Extrinsic pathwayIn

25、trinsic pathwayActivation of caspase-2 is required for permeabilization of mitochondria, release of cytochrome c, and apoptosisPathways to cell death in C. elegans and mammalsp53 是一種抑癌基因，其生物學功能是在G期監視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖，直到DNA修復完成。如果DNA不能被修復，則誘導其調亡，在依賴P53蛋白的細胞凋亡中，P53蛋白能特異地抑制 Bcl2 的表達，但對 Bax 的表達則有明顯的促

26、進作用。在這些細胞中， P53蛋白的積累和活動引起了細胞凋亡。Ras-PI3-K-Akt（PKB）抗細胞凋亡途徑：）抗細胞凋亡途徑： -Ras-PI3-K-Akt（PKB）-Caspase9磷酸化，使其不能參與Caspase3 的活化。 -Ras-PI3-K-Akt（PKB）-Bad磷酸化，使其失去阻斷Bcl2的功能。 NF-kB與細胞凋亡：與細胞凋亡： NF-kB是一種調節基因轉錄的核因子。 NF-kB的活化抑制了Caspase8的活化，從而阻值了下游Caspase活化以及細胞凋亡。ASK1-SAPK/JNK及及ASK1-p38信號途徑：信號途徑： -ASK1（apoptosis signa

27、l regulating kinase)，是一種哺乳類的MAPKKK。在哺乳類細胞中，有三套MAPK信號組件：RaF-MAPKK-MAPKK，MEKK-MKK4-JNK，MKK3-p38（一種MAPK）。 -ASK1能選擇地活化MEKK-MKK4-JNK，MKK3-p38（一種MAPK），引起細胞凋亡。l又稱老化，通常指生物發育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機能減退，內環境穩定性下降，結構中心組分退行性變化，趨向死亡的不可逆的現象。 l衰老和死亡是生命的基本現象，衰老過程發生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平以及分子水平等不同的層次。 Hayflick 界限：細胞，至少是培

28、養的細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限。“不死性”學說的錯誤在于： 癌細胞或培養的細胞系是不正常細胞，其染色體數目或形態已經不同于原先的細胞。 細胞的增殖能力與供體年齡有關。 物種壽命與培養細胞壽命之間存在著一定的關系。 衰老的原因在于細胞本身。細胞來源人胚胎成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數 40-60 20 2-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數在機體內，細胞的衰老和死亡是常見的現象，甚至在個體發育的早期也會發生。正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們

29、 會不會衰老？ 衰老動物體內，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明 顯延長。 衰老個體內的環境因素影響了細胞的增殖和衰老。 骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也 趨緩慢。細胞核的變化細胞核的變化：核膜內折，染色質固縮化。內質網的變化內質網的變化: 衰老動物內質網成分彌散性地分散于核周胞質中，粗面內質網的總量似乎是減少了。線粒體的變化：線粒體的變化：通常，細胞中線粒體的數量隨年齡增大而減少，而其體積則隨年齡增大而增大。致密體的生成：致密體的生成：由溶酶體和線粒體轉化而來。膜系統的變化膜系統的變化 衰老的細胞，其膜流動性降低、韌性減小。 衰老細胞間間隙連接及膜內顆粒的分布也

30、發生變化。核 增大、染色深、核內有包含物染色質 凝聚、固縮、碎裂、溶解質膜 粘度增加、流動性降低細胞質 色素積聚、空泡形成線粒體 數目減少、體積增大、mt DNA突變或丟失高爾基體 碎裂尼氏體 消失包含物 糖原減少、脂肪積聚核膜 內陷尼氏體：圍繞某些感覺神經末梢的卵圓形同心層狀結構 。1、DNA：復制與轉錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯，甲基化程度降低。2、RNA：m RNA和t RNA含量降低。3、蛋白質：、蛋白質：含成下降，細胞內蛋白質發生糖基化、氨甲酰化、脫氨基等修飾反應，導致蛋白質穩定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白質肽斷裂，交聯而變性。氨基酸由左

31、旋變為右旋。4、酶分子：、酶分子：活性中心被氧化，金屬離子丟失，酶分子的二級結構，溶解度，等電點發生改變，酶失活。5、脂類：、脂類：不飽和脂肪酸被氧化。引起膜脂之間或與脂蛋白之間交聯，膜的流動性降低。 該理論認為，代謝過程中產生的活性氧基團或分子（reactive oxygen species，ROS）引發的氧化性損傷的積累，最終導致衰老。自由基：是一類瞬時形成的含不成對電子的原子或功能基團，普遍存在于生物系統。具有高度反應活性，可引發鏈式自由基反應，引起DNA、蛋白質和脂類，尤其是多不飽和脂肪酸等大分子物質變性和交聯，損傷DNA、生物膜、重要的結構蛋白和功能蛋白，從而引起衰老各種現象的發生。

32、ROS主要有三種類型： O2-，即超氧自由基； OH-，即羥自由基； H2O2。（一）氧化性損傷學說（一）氧化性損傷學說:內源性自由基是人體自由基的主要來源，其產生的主要途徑有： 由線粒體呼吸鏈電子泄漏產生； 由經過氧化物酶體的多功能氧化酶（MFO）等催化底物羥化產生。 機體血紅蛋白、肌紅蛋白中還可通過非酶促反應產生自由基。清除ROS，就可以延長壽命。正常細胞內存在清除自由基的防御系統，包括酶系統和非酶系統：酶系統：SOD，CAT，GR等；非酶系統：維生素E，醌類等電子受體。 細胞增殖次數與端粒細胞增殖次數與端粒DNA長度有關。長度有關。 體細胞染色體的端粒DNA會隨細胞分裂次數增加而不斷縮短。細胞DNA每復制一次端粒就縮短一段，當縮短到一定程度至Hayflick點時，可能會啟動DNA損傷檢測點（DNA damage checkpoint），激活p53，引起p21表達，導致不可逆地退出細胞周期，走向衰亡。資料表明人的成纖維細胞端粒每年縮短14-18bp，可見染色體的端粒有細胞分裂計數器的功能，能記憶細胞分裂的次數。 端粒的長度與端粒酶（端粒的長度與端粒酶（telomerase）的活性有關。）的活性有關。 端粒酶是一種反轉錄