1、    復制缺陷型人IL-2重組腺病毒的制備與鑒定        【 摘要 】目的將人IL-2的重組腺病毒載體與Ad5腺病毒DNA末端肽復合物同源重組，高效制備人IL-2的復制缺陷型重組腺病毒，并進行體外表達和活性檢測。 方法將含全部編碼序列的人IL-2 cDNA置于真核表達載體pCIcc的CMV啟動子下游，切出含CMV啟動子、人IL-2 cDNA和SV40 poly A信號肽序列的ClaI片段，插入E1區替代的腺病毒載體pAxlow，選擇左向轉錄的人IL-2重組腺病毒載體p

2、Axlcw.CIhIL-2與經EcoT22酶切的Ad5腺病毒DNA-末端肽復合物共轉染293細胞；通過同源重組獲得人IL-2的復制缺陷型重組腺病毒；體外轉染人宮頸癌HeLa細胞、人T細胞淋巴瘤Hut78細胞和原代人皮膚成纖維細胞。 結果擴增到的病毒滴度達2.1×109PFU/ml;體外轉染的人腫瘤細胞均檢測到IL-2的表達(4002600U/106細胞/24小時)。 結論所制備的復制缺陷型重組腺病毒能有效介導人IL-2的基因轉移，可望用于腫瘤基因治療的臨床研究。【 主題詞 】白細胞介素2腺病毒載體基因轉移基因表達 Preparation and identification of r

3、eplication-deficient human interleukin-2 recombinant adenoviruses Zhang Weiping*,Cao Xuetao,Hamada Hirofumi.*Department of Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433AbstractThe full-length human IL-2 encoding cDNA was placed at the downstream of CMV promoter of the expressing vect

4、or pCIcc, and the resultant ClaI fragment containing CMV promoter,hIL-2 cDNA and SV40 polyA signals was inserted into E1-substituted adenovirus vector pAx1cw.Subsequently,the hIL-2 recombinant adenovirus vector was cotransfected into 293 cells together with EcoT22I-digested Ad5-TPC,and by homologous

5、 recombination the replication-deficient hIL-2 recombinant adenovirus was generated efficiently with a titer of 2.1×109 pfu/ml.Infected with prepared hIL-2 recombinant adenovirus in vitro,HeLa cells, Hut78 T lymphoma cells and human skin fibroblasts expresed high levels of hIL-2(4002600U/106cel

6、ls /24h)48 hours after infection.These suggest that COS/TPC is an efficient method to prepare recombinant adenoviruses and the prepared hIL-2 adenovirus could be used in cancer gene therapy.Subject wordsInterleukin-2Adenovirus vectorGene transferGene therapy選擇有效的目的基因和基因導入途徑是基因治療的關鍵。白細胞介素2(Interleuki

7、n-2,IL-2)是目前腫瘤免疫基因治療中療效較為肯定的目的基因，截至1996年9月，已有24項IL-2基因治療的臨床方案經美國FDA等批準用于治療惡性黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腦膠質瘤和神經母細胞瘤等晚期腫瘤患者1。腺病毒載體具有感染效率高等突出優點，已應用于基因治療的臨床研究。傳統的重組腺病毒制備方法是將重組腺病毒載體與切除了末端肽(Terminal Peptide,TP)的腺病毒DNA進行同源重組，效率不夠理想。我們將人IL-2的重組腺病毒載體與Ad5腺病毒DNA-TP復合物同源重組2，3，高效制備人IL-2的復制缺陷型重組腺病毒，并在體外進行了有效表達。材

8、料與方法1.主要試劑：pBluescript-SK載體(Stratagene)，真核表達載體pCIcc3，E1區替代的腺病毒載體pAx1cw(日本東京大學Saito博士惠贈)，噬菌體蛋白包裝試劑盒(Stratagene),Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶及限制性內切酶(NEB)，基因重組人IL-2(Genzyme,比活為1×107U/mg)，CsCl(Gibco)。2.細菌和細胞株：菌株DH5a(本室保存)，MC1061(ATCC53338)；人胚腎細胞株293(ATCC CRL1573)，人宮頸癌細胞株HeLa(ATCC CCL2)，人T細胞淋巴瘤細胞株Hut78(ATCC

9、 TIB161)，IL-2依賴的CTLL-2細胞株(ATCC，TIB214)，人原代皮膚成纖維細胞(本室分離培養)。3.人IL-2 cDNA的克隆：以本室構建的人IL-2重組載體pUC18-hIL-24為模板行PCR擴增。擴增的5'引物為5'GAATTCGCTAGCTACCATGTACAGGATGCAACTCCT(含設計的EcoRI和NheI位點)，3'引物為5'GAATTCATCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC(含設計的EcoRI位點)，所擴增產物預計大小為484bp。PCR反應體積為50l，引物濃度為0.4mol/L，擴增參數為941分鐘、601分

10、鐘、722分鐘，25個循環后產物行2%瓊脂糖膠凝電泳分析。PCR產物經EcoR酶切后，克隆至pBluescript-SK(重組載體記為pSK-hIL-2)，用T3和KS引物進行DNA全自動雙向測序。4.人IL-2腺病毒載體的構建：如1所示，將pSK-hIL-2的EcoRI小片段(480bp)克隆至載體pCIcc，正向重組子記為pCI-hIL-2，此重組載體中的Cla小片段(1825bp)含有CMV啟動子、hIL-2 cDNA和SV40 polyA序列，將此表達單元與pAx1cw的Cla大片段連接，連接反應液經噬菌體蛋白體外包裝后感染DH5a細菌，選擇左向轉錄的人IL-2重組腺病毒載體pAx1c

11、w.CI-hIL-2,大量制備其DNA 、CsC1超離心純化后備用。5.腺病毒DNA-TPC的制備：詳見文獻3。經EcoT22酶切后備用。6.COS/TPC共轉染：pAx1cw.CI hIL-2(40g)與DNA-TPC(0.5g)共轉染293細胞，過夜后，共轉染的293細胞與未經轉染的293細胞按不同比例混合接種至96孔培養板(100l/孔)，此后的第4天和第8天各補加培養基(50l/孔)，于共轉染后的第1214天，收集陽性克隆孔的細胞及其培養液，超聲破碎后病毒上清(1st seed)感染24孔中的293細胞(設2個復孔)；34天收集一個復孔中的細胞進行細胞基因組DNA的酶切分析，另一復孔中

12、的細胞經超聲破碎后收集病毒上清(2nd seed),留作擴增用。1pSK-hIL-2和pCI-hIL-2重組載體構建流程Fig 1.Demonstrative illustration for the construction of pSK-hIL-2 and pCI-hIL-2 recombinant vectors7.重組腺病毒的擴增與滴度檢測：詳見文獻3。用酶切鑒定正確的重組克隆的病毒上清(2nd seed)感染293細胞，所擴增的病毒經過濾后于-80貯存。病毒滴度的檢測以293細胞為靶細胞，病毒液從10-4稀釋度開始行3倍的倍比稀釋，每一稀釋度設8個復孔，1214天后判定結果。8.人I

13、L-2重組腺病毒的體外表達：對數生長期的HeLa細胞、Hut78或原代培養的人皮膚成纖維細胞，棄培養液、洗二遍后，按不同的重復感染度(Multiplicity of Infection,MOI)加人LacZ或人IL-2的重組腺病毒，1小時后洗棄病毒液，加入正常培養液，48小時后收集培養上清，檢測IL-2活性(以U/106細胞/24小時表示)。9.IL-2活性的檢測：CTLL-2細胞為檢測細胞，方法詳見文獻4。 結果1.人IL-2 cDNA的基因克隆：通過PCR克隆到了相當于預計大小的人IL-2 cDNA，克隆至pBluescipt-SK載體后，經全自動DNA測序，其基因序列與報道一致，包含全部

14、編碼序列5和所設計的酶切位點。2.人IL-2重組腺病毒載體的構建：腺病毒載體pAx1cw3來源于cosmid載體charomid9-28，攜帶E1區(mu 1.3-9.3)和E3區(mu 79.6-84.8)缺失的Ad5腺病毒基因組DNA，含有Swa和Cla兩個克隆位點。先將有IL-2 cDNA克隆至pCIcc載體的EcoR位點，構建成重組載體pCI-hIL-2，將其中含CMV啟動子、人IL-2 cDNA、SV40 polyA信號序列的Cla片段克隆至腺病毒載體pAx1cw的C1a位點，選擇左向轉錄的重組腺病毒載體pAx1cw.CI-hIL-2。2COS/TPC同源重組法產生人IL-2重組腺病

15、毒示意Fig.2 Skematic demonstration for the generation of human IL-2 recombinant adenovirusby COS/TPC homologous recombination3.人IL-2重組腺病毒的制備：左向轉錄的重組腺病毒載體pAx1cw.CI-hIL-2與Ad5DNA-TPC共轉染293細胞，經同源重組(2)，1214天后產生復制缺陷型的人IL-2重組腺病毒；經酶切鑒定(3)，陽性重組克隆的基因組DNA中有一與所插入的表達單元大小相當的Cla片段(1825bp)，而對照293細胞的基因組中則無此片段。3人IL-2重組腺

16、病毒細胞克隆的基因組酶切分析Fig3.Digestive analysis for the genomic DNA from the 293 cell clones generating recombinanthuman IL-2 adenovirusesLane 1. Cla digests of control 293 cellsLane 2. Cladigests of hIL-2 adenovirus clone Lane 3. /BstE DNA marker4.重組腺病毒介導的人IL-2體外表達：首先用LacZ重組腺病毒感染HeLa細胞、Hut78細胞和原代培養的人皮膚成纖維細胞，

17、通過X-Gal染色對腺病毒介導的基因轉移效率進行評估。結果顯示，當MOI值為50100時，感染率接近100%，表明重組腺病毒能有效地介導基因轉移。IL-2檢測結果表明，未感染人IL-2重組腺病毒或感染LacZ的HeLa細胞和人皮膚成纖維細胞的培養上清中未檢測出IL-2，Hut78細胞分泌低水平的IL-2(50U/106細胞/24小時)；感染人IL-2重組腺病毒后48小時(見附表)，培養上清中可檢測到不同水平的人IL-2(4002600U/106細胞/24小時)，而且隨著感染時的MOI值的增加，IL-2表達水平呈上升趨勢，證明我們所制備的人IL-2重組腺病毒在體外能高效表達人IL-2。 附表感染

18、人IL-2重組腺病毒的細胞分泌IL-2水平Table. The IL-2 expression levels of the cells infected with recombinanthuman IL-2 adenovirusesInfected cellshIL-2 levels at different MOI(U/106 cells/24h)050100200HeLa cells0757.9±63.81872.5±140.32608.4±225.6Skin fibroblasts0632.4±60.91371.3±109.42434.6

19、±192.1Hut78 cells48396.7±50.4874.6±75.41225.6±108.6討論IL-2是目前腫瘤免疫基因治療中研究最多、療效最為確實的目的基因之一1，611，其導入機體的途徑包括：(1)導入TIL、CTL等免疫效應細胞，進行免疫過繼治療；(2)導入腫瘤細胞，制備成瘤苗用于腫瘤的主動性免疫治療；(3)借助于成纖維細胞等載體細胞將其攜帶至體內表達；(4)直接體內或瘤體內注射。以上途徑介導的人IL-2腫瘤免疫基因治療方案均已經美國FDA等機構批準進入臨床試驗。目前大多數腫瘤基因治療的臨床項目采用逆轉錄病毒載體介導目的基因的轉移。盡管

20、逆轉錄病毒載體介導的基因轉移具有外源基因穩定表達等優點，但在臨床應用中也存在明顯的不足，如基因轉染效率不夠理想，僅能感染分裂期的細胞；病毒的滴度較低不能滿足臨床治療較大實體瘤的需要；來自非人源化包裝細胞的重組逆轉錄病毒進入人體后易被補體所滅活等等。因此基因治療的臨床研究迫切需要更有效的基因轉移途徑。腺病毒載體感染效率高，體內外均能有效感染分裂期和靜息期的細胞；外源基因表達水平高；重組腺病毒的大規模制備相對容易，并且病毒滴度高，能滿足臨床的需要。腺病毒載體DNA以附加體的形式存在于染色體之外，在細胞的分裂增殖過程中逐漸丟失，因此目的基因的表達相對短暫，這對于遺傳病的基因治療來說是一大缺點，但對腫

21、瘤的細胞因子基因治療來說，并不需要導入的細胞因子基因在體內長期地表達，所以它仍是一合適的載體系統。我們采用已被美國FDA批準用于臨床的E1區替代型Ad5復制缺陷型腺病毒，通過COS/TPC同源重組，制備人IL-2重組腺病毒。腺病毒基因組為線性雙鏈DNA，其5?末端與一分子量大小為55×103的末端肽(TP)共價結合，TP的存在對腺病毒DNA的感染能力有著重要的影響(結合了TP的DNA的感染能力可增強100倍)。傳統的重組腺病毒制備方法將重組腺病毒載體與用蛋白酶切除了TP的腺病毒DNA進行同源重組，效率不夠理想。Saito等2首先采用與EcoT22I消化DNA-TPC(E3區缺失的腺病

22、毒DNA有7個EcoT22I位點)同源重組，使得重組效率大大提高，同時也降低了產生親本腺病毒的機率。考慮到親本病毒產生的主要原因是最左端的兩個EcoT22I片段意外地連接，DNA-TP中E1區的存在可能會增加產生親本病毒的機率，我們改用了E1和E3區都缺失的DNA-TPC(具有4個EcoT22I位點)，結果表明產生親本病毒的機率并沒有因為經EcoT22I片段的減少而增加。我們所制備的人IL-2復制缺陷重組腺病毒體外感染來源于上皮的HeLa細胞、T淋巴瘤細胞Hut78和原代人皮膚成纖維細胞，均能有效表達IL-2，表明其可望用于腫瘤基因治療的臨床研究。 本研究受國家九五科技攻關項目(96-906-

23、01-20)資助作者單位：200433 上海，第二軍醫大學免疫學教研室(章衛平，曹雪濤)；日本癌研究會腫瘤研究所(濱田洋文)參考文獻1Roth J and Cristiano R.Gene therapy for cancer:what have we done and where we are going? J Natl Cancer Inst,1997,8921-39.2Miyake S,Makimura M,Kanegae Y,et al.Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-termi

24、nal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome.Proc Natl Acad Sci USA,1996,931320-1324.3章衛平，曹雪濤，濱田洋文.COS/TPC同源重組法高效制備人B7(CD80)-重組腺病毒.中國腫瘤生物治療雜志， 1997，46-10.4章衛平，曹雪濤，王建莉，等.人白細胞介素2重組逆轉錄病毒載體的構建與表達.中國腫瘤生物治療雜志，1996，3423-427.5Taniguchi T,Matsui H,Fujita T,et al.Structure and expresion of a cloned cDNA for human interl